牛肉水煮液对脑缺血大鼠外周血白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的影响

马茜 朱洁 王辛 王爱红

牛肉水煮液对脑缺血大鼠外周血白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的影响

马茜 朱洁 王辛 王爱红

目的 观察不同剂量牛肉水煮液对局灶性脑缺血大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响。方法 将60只雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组及低剂量〔200 mg/(kg·d)〕、中剂量〔400 mg/(kg·d)〕和高剂量〔600 mg/(kg·d)〕牛肉水煮液组，每组12只。采用线栓法复制局灶性大脑中动脉缺血模型，造模后2 h用Longa法对大鼠进行神经功能评分，造模后7 d，再次进行神经功能评分；用2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)染色法测定脑梗死体积；用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清IL-6、TNF-α水平。结果 造模2 h和7 d后，各剂量牛肉水煮液组Longa评分和模型组相比无统计学差异(P>0.05)；和模型组相比，中、高剂量牛肉水煮液组大鼠脑梗死体积分数明显减小(P<0.01)；与假手术组相比，模型组血清IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.01)，给予高剂量牛肉水煮液组可明显降低其水平(P<0.01，P<0.05)。结论 高剂量牛肉水煮液可显著改善脑缺血大鼠的脑梗死体积，降低血清IL-6、TNF-α水平，这可能是牛肉水煮液对脑缺血神经损伤的保护作用机制之一。

牛肉水煮液；局灶性脑缺血；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α

脑卒中是世界第三大致死性疾病，其中缺血性脑卒中占85%[1]，是最常见的类型。随着对缺血性脑损伤的机制研究越来越深入，脑缺血后的炎性反应及其损伤作用日益受到关注。在脑缺血损伤病理过程中有许多炎性介质参与，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)均是重要的炎性细胞因子，二者相互作用[2]，在脑缺血后炎性反应中起重要作用。本课题组前期开发的牛肉水煮液中含有丰富的肌肽，而肌肽能调节脑缺血后的免疫功能，具有脑保护作用[3]。本研究通过观察富含肌肽的牛肉水煮液对脑缺血后血清炎性因子IL-6、TNF-α水平的影响，旨在探讨其对脑缺血大鼠炎性损伤的作用。

1 材料和方法

1.1 动物 成年健康雄性SD(SpragueDawley)大鼠60只，SPF级，体质量(300±20)g，合格证号：SCXK(京)2012-0001，由南京中医药大学实验动物中心提供。动物饲养温度控制在(19～26)℃，12h明暗循环，自由饮食和饮水，实验前适应性饲养1周，造模前12h禁食。

1.2 主要试剂和仪器 包括栓线(北京沙东生物技术有限公司)、大鼠IL-6血清检测ELISA试剂盒(南京建成生物公司)、大鼠TNF-α血清检测ELISA试剂盒(南京建成生物公司)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC，美国Sigma公司)、RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣仪器公司)、酶标仪(VICTORTMX3，美国PerkinElmer公司)、台式高速离心机(Allegra64R，美国BeckMan公司)、恒温隔水培养箱(GNP-9050，上海精宏仪器公司)。

1.3 方法

1.3.1 牛肉水煮液制备：精选牛腿肉，去血、去油脂，准确称重1kg，切成2cm3的方块，用绞肉机将肉块绞成肉糜。将自来水和肉糜同放入锅中，牛肉糜/水=1∶2，利用功率调节器，使牛肉汤2h沸腾，沸腾后继续熬制10h，总计12h。撇去浮油，倒出牛肉汤后，用漏勺把汤中的牛肉大体滤除，再用纱布二次过滤，最终得到牛肉水煮液约1500mL。最后用旋转蒸发仪浓缩25倍，得到约60mL浓缩液。经S-433D型全自动氨基酸分析仪分析，浓缩液中肌肽含量为36.34mg/mL，占氨基酸总量的63.05%。

1.3.2 脑缺血模型制作与分组：参照Longa等[4]线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。假手术组操作步骤同MCAO模型，血管分离后不插线栓。 采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、模型组及低、中、高剂量牛肉水煮液组，每组12只。排除造模失败、死亡和血标本发生溶血的情况，最终各组用于统计数据分析的大鼠只数分别为假手术组8只，模型组9只，低剂量牛肉水煮液治疗组6只，中剂量牛肉水煮液治疗组6只，高剂量牛肉水煮液治疗组9只。

1.3.3 给药：根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》[5]及动物与人剂量换算方法[6]，牛肉水煮液剂量的确定以汤中肌肽含量为标准，低、中、高剂量组分别按体质量200、400、600mg/(kg·d)牛肉水煮液灌胃，分别相当于人体推荐摄入量的10、20、30倍。于术后2h第1次给药，之后每天早晚各给药1次，持续7d。假手术组和模型组给予相同体积的生理盐水。

1.3.4 神经功能评分：采用Longa等[4]评分方法，于大鼠MCAO术后清醒约2h和7d两个时间点进行神经功能缺损评分。评分标准为：0分，无神经功能缺失，活动正常；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，爬行时出现向瘫痪侧转圈；3分，爬行时向瘫痪侧倾倒；4分，不能自行行走，有意识障碍。得分越高表明神经功能缺损程度越重，相反损害较轻。术后评分1～3分者为MCAO模型制作成功；0分、4分者均视为MCAO模型制作失败，剔除。

1.3.5 脑组织切片TTC染色：术后7d，将每组6只大鼠用10%(体积分数)水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，迅速在冰皿上断头取脑，放入-20 ℃冰箱冰冻20min，将其置于大鼠脑切片模具中，去嗅球和低位脑干，间隔2mm连续冠状切片5片，将脑片置入2%(质量浓度)TTC溶液中，在37 ℃条件下避光孵育30min。正常脑组织为深红色，脑梗死区呈灰白色。再将脑片置于4%(质量浓度)多聚甲醛中固定24h，用数码相机拍照，ImagePro-Plus6.0分析图像。脑梗死体积分数(%)=患侧梗死面积/对侧半脑面积×100%。

1.3.6 酶联免疫吸附法(ELISA法)：术后7d，各组大鼠用10%(体积分数)水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，左心室取血，全血在37 ℃环境下孵育30min，以587 g离心10min(低温)，吸取上清，立即放入-80℃冰箱冷冻保存。采用ELISA方法检测血清中IL-6、TNF-α的水平，实验方法严格按照试剂盒说明书逐步操作，最后在酶标仪450nm处测吸光度〔D(λ)〕值。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件包分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示(脑梗死体积、血清IL-6、TNF-α水平)，多组均数间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用LSD法；不符合正态分布的计量资料用中位数(第25百分位数，第75百分位数)表示，采用多个独立样本的非参Kruskal-Wallis检验(神经功能评分)。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 假手术组未见神经功能缺损表现，模型组和牛肉水煮液组造模后均出现肢体瘫痪，且各剂量牛肉水煮液组神经功能评分与模型组比较无统计学差异(P>0.05)。造模后7d，模型组和治疗组仍存在神经功能缺陷，和模型组相比，各剂量的牛肉水煮液治疗组神经功能评分均呈下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表 1 各组大鼠神经功能评分的比较

注：表中数据为中位数(第25百分位数，第75百分位数)

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 假手术组脑组织无梗死灶，模型组和各治疗组右侧大脑中动脉供血区的大脑皮质、纹状体等处可见明显梗死灶(图1)。模型组以及低、中、高剂量牛肉水煮液组脑梗死体积分数分别为(40.82±4.86)%、(33.95±3.62)%、(21.76±3.54)%、(21.19±5.50)%，各组间比较差异有统计学意义(F=4.463，P<0.05)，且中、高剂量牛肉水煮液组脑梗死体积分数较模型组减小(P<0.01)。

图1 各组大鼠脑缺血7 d后脑梗死体积比较(TTC染色)

2.3 各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较 模型组大鼠脑缺血后7 d，IL-6和TNF-α水平与假手术组比较明显升高(P<0.01)；与模型组比较，高剂量牛肉水煮液组IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.01和P<0.05)；另外，高剂量牛肉水煮液组IL-6水平较低剂量组显著降低(P<0.05)。具体结果见表2。

表 2 各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较

注：IL-6：白细胞介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05

3 讨论

缺血性脑血管病是常见病、多发病，病死率和致残率均高。脑缺血后损伤是一个复杂的病理级联反应，其发病机制包括细胞内炎性反应、氧化应激、Ca2+稳态失调等，其中过度炎性免疫反应存在于脑梗死坏死及缺血区域，导致炎性损伤。IL-6和TNF-α作为重要的炎性细胞因子，是炎症损伤信号链中的上游信号分子，介导了炎性损伤和损伤修复信号网络的启动。脑缺血损伤早期，局部受损的神经元、大脑血管内皮细胞及活化小胶质细胞和星形胶质细胞可释放炎性细胞因子IL-6和TNF-α，介导局部炎性反应。随着血液再通或血-脑屏障结构的破坏，中枢脑区炎性损伤相关的炎性反应信号可通过血液传递至外周，活化外周免疫系统中的炎性细胞，释放炎性因子[7]。该研究结果显示，模型组大鼠外周血清中可见大量IL-6和TNF-α表达，并且在脑缺血后7 d，表达仍高于正常状态。这与既往研究结果一致[8-9]。

中医古籍《医林纂要》指出，“牛肉味甘，专补脾土”。《本草拾遗》也指出，牛肉“消水肿，除湿气，补虚，令人强筋骨、壮健”。牛肉汤入药始见于朱丹溪《格致余论·倒仓论》中“倒仓法”，所用之药，只黄牛肉一味，丹溪云可“治瘫、痨、蛊、癞诸证”，且具有寓攻于补，攻邪而不伤正，扶正而不助邪的特点。现代营养学研究也表明，牛肉富含蛋白质、B族维生素及矿物质(钾、锌、镁、铁等)[10]，具有抗氧化、增强免疫力、促进蛋白质的新陈代谢和合成、增强肌力的作用。牛肉中蛋白质含量尤其丰富，由人体必需的8种氨基酸组成，且比例均衡，熬制成汤后，很多水溶性的氨基酸溶解到汤中，汤刺激胃酸分泌，更利于营养吸收。脑卒中患者由于能量大量消耗，容易出现负氮平衡，低蛋白血症，造成营养不良[11]，而营养不良是感染等并发症的重要基础，也是影响脑卒中预后的重要原因之一，牛肉及牛肉汤中富含各种优质蛋白，对脑卒中后患者营养的补充有益。2012年宾州大学的一项研究[12]发现，每天食用4.0～5.4盎司瘦牛肉，与开始实验时比较，其低密度脂蛋白(LDL)降低了10%，而LDL升高是动脉粥样硬化发生、发展的主要脂质危险因素，是脑卒中发生的关键所在。

此外，本课题组前期采用简单工艺制作牛肉水煮液，经S-433D型全自动氨基酸分析仪检测，其中肌肽含量丰富。肌肽是一种含组氨酸的二肽，一般存在于脊椎动物骨骼肌中，以往研究表明[13]，肌肽具有抗氧化、抗凋亡、抗炎性反应、清除自由基、抗糖基化、调节免疫等作用，从而发挥脑保护作用，减轻脑缺血损伤。本课题组前期研究显示肌肽可调节外周血T淋巴细胞亚群表达，改善外周免疫抑制状态[3]，进一步证实了肌肽对缺血性脑卒中的免疫调节作用。本研究通过建立永久性大脑中动脉缺血模型，观察富含肌肽的牛肉水煮液对脑缺血大鼠外周血炎性因子IL-6、TNF-α水平的影响，旨在探讨牛肉水煮液是否具有抗炎作用。

本研究结果显示：假手术组血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α基础水平较低，造模后7 d，模型组IL-6、TNF-α水平显著增高，提示炎性因子IL-6、TNF-α参与脑缺血损伤过程；予不同剂量牛肉水煮液处理后，升高的IL-6、TNF-α水平呈现不同程度下降趋势，提示牛肉水煮液可降低脑缺血后IL-6、TNF-α水平，抑制炎性反应，从而减轻脑缺血时炎性浸润对脑组织的损害。而既往研究显示[14]肌肽能抑制缺血再灌注损伤的炎性因子，如IL-6、TNF-α、核因子κB1等的表达。因此推测牛肉水煮液中的丰富的肌肽成分在脑缺血后抗炎作用中发挥了重要作用，但牛肉水煮液中其他成分，如脂肪、维生素、矿物质等是否也起到一定作用，还有待进一步探讨。本研究结果还显示，与模型组相比，低、中剂量牛肉水煮液组IL-6、TNF-α水平虽有下降趋势，但无统计学意义，而高剂量牛肉水煮液组IL-6、TNF-α水平下降显著，并且高剂量组IL-6水平明显低于低剂量组，提示高剂量牛肉水煮液对IL-6、TNF-α的调节作用最理想。

另外，本实验在造模后7 d观察各组大鼠脑梗死体积发现，与模型组比较，中、高剂量组可明显减小脑梗死体积，表明中、高剂量牛肉水煮液可减轻局灶性脑缺血大鼠的脑损伤。此结果与不同浓度牛肉水煮液对血清IL-6、TNF-α水平影响的变化趋势相一致，推测其脑保护作用可能是通过减少脑缺血后炎性因子水平实现。这与既往的研究结果相一致[15]。但其脑梗死范围和血清IL-6、TNF-α水平是否有相关性，尚需要进一步探讨。

造模后2 h，各组大鼠神经功能评分无统计学差异；造模后7 d，低、中、高剂量牛肉水煮液组神经功能缺损评分与模型组相比，虽有随剂量下降的趋势，但无统计学差异。导致这一结果的原因可能有3方面：(1)本实验样本量较小；(2)本实验的神经功能评分方法采用Longa等的五级四分法，且排除了脑损伤过轻(0分)和过重(4分)的大鼠，导致脑缺血大鼠的神经功能评分的差异性较小；(3)牛肉水煮液属于食物，其功能上还不足以在短时间内对神经症状起到明显的改善作用。

综上所述，牛肉水煮液可以减小局灶性脑缺血后的脑梗死体积，降低脑缺血大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α的水平，减轻脑缺血后的炎性病理过程，具有神经保护作用，这可能与其富含肌肽有关。牛肉水煮液取材方便，制作工艺简单，作为一种简单食疗方可以纳入临床脑卒中患者的饮食方案，辅助脑卒中患者的治疗。但是牛肉水煮液发挥抗炎作用所需时间以及持续时间还需进一步探讨。

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(本文编辑：时秋宽)

Effect of beef decoction on levels of serum interleukin-6 and tumor necrosis factor-α in rats of cerebral infarction

MAQian,ZHUJie,WANGXin,WANGAihong*.

*Institute of Nursing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing Jiangsu 210023, China

WANGAihong,Email:wah710630@163.com

ObjectiveToinvestigatetheneuroprotectiveeffectofbeefdecoction(BD)ontheserumlevelsofinterleukin-6 (IL-6)andtumornecrosisfactor-α(TNF-α)inmiddlecerebralarteryocclusionmodel(MCAO)rats.MethodsSixtySDratswererandomlydividedintofivegroups：sham-operatedgroup,modelgroup,lowdosageBD-treatedgroup[200mg/(kg·d)],middledosageBD-treatedgroup[400mg/(kg·d)]andhighdosageBD-treatedgroup[600mg/(kg·d)],therewere12ratsineachgroup.IntraluminalthreadmethodswereappliedtoestablishtheMCAOinthemodelgroupandthethreeBDtreatedgroups.TheneurologicalfunctionwasscoredwithLonga5-pointscaleat2hand7daysaftermodeling,thecerebralinfractvolumewasrevealedby2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC)stain,andtheserumlevelsofIL-6andTNF-αweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)methods.ResultsBoth2hand7daysafterMCAO,comparedwiththemodelgroup,theneurologicalfunctionscoresoftheBD-treatedgroupswerenotsignificantlydifferent(P>0.05).TheinfarctionvolumesoftheBD-treatedgroupsweresmallerthanthoseofthemodelgroup,andstatisticallysignificantlyreducedinthehighandmiddledosagegroups(P<0.01).ThelevelsofIL-6andTNF-αinthemodelgroupweremuchhigherthanthoseinthesham-operatedgroup(P<0.01),whilethelevelsofIL-6andTNF-αinthehighdosageBDgroupwerelowerthanthoseinthemodelgroup(P<0.01，P<0.05).ConclusionsHighdosageBDiseffectivetoreduceinfractvolumeandrestrainIL-6andTNF-αexpression,thismaybeitsprotectivemechanismofBDoncerebralischemia.

beefdecoction；localcerebralischemia；interleukin-6；tumornecrosisfactor-α

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.015

江苏省青蓝工程项目资助、江苏省优势学科项目资助项目(编号：YSHL0201-26)

210023 南京中医药大学护理学院

王爱红，Email：wah710630@163.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)01-0062-05

2014-08-20)