水通道蛋白-5对结直肠癌淋巴结转移的作用及机制

吕柏楠 石晓明 吴胜春 唐雷 杨永宾

水通道蛋白-5对结直肠癌淋巴结转移的作用及机制

吕柏楠 石晓明 吴胜春 唐雷 杨永宾

目的:检测水通道蛋白-5(AQP-5)在结直肠癌中的表达情况，分析TAZ与肿瘤淋巴结转移情况及患者预后的关系;同时检测肿瘤侵袭转移蛋白金属基质蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白的表达，并对其意义进行分析。方法收集98例区域淋巴结转移阳性的结直肠癌及40例癌旁正常组织石蜡组织标本，免疫组化(SP)染色检测AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表达情况。记录患者的临床资料并进行随访，分析AQP-5对结直肠癌淋巴结转移及预后的意义，并对AQP-5与肿瘤侵袭转移蛋白的关系进行分析。结果AQP-5、MMP-2、MMP-9在肿瘤组织中表达高于癌旁组织，TIMP-1、TIMP-2表达则低于癌旁组织(P＜0.05)。AQP-5、MMP-2蛋白表达水平均与淋巴结转移数目呈正相关(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示，AQP-5阳性者生存期较短(P＜0.05)。在结直肠癌组织中AQP-5与MMP-2、MMP-9、TIMP-1之间均有相关性(P＜0.05)。结论AQP-5蛋白可促进结直肠癌的淋巴结转移，AQP-5阳性是患者预后较差的标志。AQP-5的这种作用可能是通过调节侵袭转移蛋白实现的。

结直肠癌;水通道蛋白-5;转移，淋巴结;预后;侵袭转移蛋白

近年来我国结直肠癌的发病率及死亡率不断升高，严重危害人们健康。肿瘤的淋巴结转移是导致结直肠癌进展的主要原因之一，但迄今导致结直肠癌转移的机制还没有完全阐明。确定转移调控基因对结直肠癌的病情判断及诊治意义重大。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类存在于细胞膜上的膜转运蛋白，AQP-5即为其中成员之一。研究发现AQP-5与肺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤有关［1－3］，在结直肠癌中也存在异常表达［4］，但临床意义及作用机制报道不多。在肿瘤细胞的转移过程中，金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族发挥了重要作用［5，6］。本研究检测了AQP-5及MMPs家族中主要成员MMP-2、MMP-9及其抑制物金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)、TIMP-2的表达，分析了AQP-5在结直肠癌的临床及预后意义，并分析了AQP-5与MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在肿瘤中的关系，探讨了AQP-5在结直肠癌淋巴结转移过程中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料2011年4月至2012年3月于我院手术切除的结直肠癌组织石蜡标本98例，术后病理证实其中62例伴有区域淋巴结转移。所有病例术前均未行放疗和化疗。患者均有完整的临床及随访资料。患者中男66例，女32例;年龄33～76岁，平均年龄(58.2±16.8)岁。以40例结肠镜检查及其他手术中获得的正常结直肠黏膜组织石蜡标本为对照。AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9兔抗人多克隆抗体均为美国Santa Cruz公司产品，SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物公司。

1.2 免疫组化方法及结果判断厚约4 μm的石蜡切片脱蜡水化后严格按照免疫组化(SP法)试剂盒说明书进行操作。用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS为阴性对照。根据组织阳性细胞百分比和染色强度综合评分，随机取10个400×高倍镜视野，每视野计数100个细胞。AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为染色阳性。计分方法:无阳性细胞计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。染色强度计分:未着色0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。根据样本阳性细胞百分比和染色强度计分之和的结果分为≤3分为弱阳性;≥4分为强阳性。

1.3 统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计数资料采用χ2检验，组间相关性采用Spearmann相关分析，对患者的生存分析应用Kaplan-Meier法统计并绘制生存曲线，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在结直肠癌中表达情况AQP-5、MMP-2、MMP-9在结直肠癌原发灶中阳性表达率明显高于正常结直肠癌黏膜(P ＜0.05);肿瘤组织TIMP-1、TIMP-2蛋白的阳性表达率明显低于正常结直肠癌黏膜(P＜0.05)。见表1。

表1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在结直肠癌组织、正常黏膜中的表达情况例(%)

2.2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在结直肠癌组织表达情况与淋巴结转移的关系收集62例淋巴结转移阳性的患者资料，按UICC(2009年第7 版)淋巴结(N)分期的判断，将淋巴结转移分为N1组(淋巴结转移＜4枚)和N2组(淋巴结转移≥4枚)。 AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9蛋白阳性表达与淋巴结转移程度有明显关系，AQP-5、MMP-2、MMP-9蛋白在N2组表达比N1组增强，而TIMP-1、TIMP-2蛋白则在N1组表达强于N2组(P＜0.05)。见表2。

表2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白表达与结直肠癌淋巴结转移数目关系例(%)

2.3 AQP-5表达情况与结直肠癌患者预后的关系根据结直肠癌组织中AQP-5的表达情况与预后的关系进行Kaplan-Meier分析并绘制生存函数曲线，发现AQP-5阳性表达患者的生存率低于阴性患者(χ2= 13.74，P＜0.01)。见图1。

2.4 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白在结直肠癌肿瘤中表达的相关性在98例结直肠癌肿瘤中，AQP-5蛋白表达与MMP-2、MMP-9蛋白表达均呈正相关性(r=0.276，0.308;P=0.006，0.002)，AQP-5蛋白表达与TIMP-1、TIMP-2蛋白表达呈均负相关性(r=－0.328，－0.242;P＜0.001，0.016)。TIMP-1蛋白表达与MMP-2、MMP-9蛋白表达呈均负相关性(r=－0.366，－0.308;P＜0.01)，TIMP-2蛋白表达与MMP-2、MMP-9蛋白表达也呈均负相关性(r =－0.226，－0.204;P=0.025，0.044)，MMP-2蛋白表达与MMP-9蛋白表达呈正相关性(r=0.407，P＜0.01)。

图1 结直肠癌患者AQP-5表达与预后关系的Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

结直肠癌进展、转移是多种基因造成的，分子机制复杂，确定转移新基因有重要的意义。本研究对与结直肠癌淋巴结转移有关的新基因水通道蛋白-5(aquaporin-5，AQP-5)的作用和临床意义进行了研究。AQP-5基因在人类定位于染色体12q3，cDNA全长约1.8 kb，包含4个外显子和3个内含子［7］。AQP-5与多种恶性肿瘤相关。研究发现AQP-5在宫颈癌中存在过表达，与临床特征及预后有关［8］;还有研究表明AQP-5参与顺铂对卵巢癌细胞的增殖抑制，是卵巢癌的潜在治疗靶基因［9］。另有研究发现AQP-5在结肠癌组织中高表达，且与结直肠癌的一些病理特征有关［4］。这些都说明AQP-5表达增高与肿瘤发生进展关系密切。本结果发现结直肠癌组织中AQP-5表达明显比正常黏膜增强，说明AQP-5参与了结直肠癌的形成与进展;结果还发现淋巴结转移较多的患者AQP-5表达更强，提示AQP-5可能对结直肠癌的淋巴结转移有促进作用，检测患者肿瘤中AQP-5表达可能对淋巴结转移情况有较好的预测作用。Kaplan-Meier分析发现AQP-5阳性表达患者的生存率低于阴性患者，说明AQP-5过表达是结直肠癌预后不良的因素，提示患者预后较差。但本研究例数较少，还需要扩大研究规模对AQP-5的临床意义予以确定。

为了解AQP-5促进结直肠癌淋巴结转移的机制，本研究还检测了与肿瘤细胞侵袭转移密切相关的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达情况。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成员，有分解细胞周围基质、促进肿瘤细胞迁移至其他部位的能力。而MMPs的抑制物TIMPs家族成员则具有抑制肿瘤细胞侵袭迁移的作用，其中主要成员为TIMP-1和TIMP-2。本研究发现，结肠癌组织中MMP-2、MMP-9表达高于癌旁正常黏膜，而TIMP-1、TIMP-2存在表达降低的现象。说明肿瘤组织中MMPs-TIMPs的动态平衡失调导致了肿瘤的发生和转移。相关分析显示在肿瘤组织中AQP-5与MMP-2、MMP-9存在正相关关系，而与TIMP-1、TIMP-2存在负相关，提示AQP-5可能通过调节下游基因及信号转导通路等方式促进MMP-2、MMP-9表达，同时抑制TIMP-1、TIMP-2表达而发挥促进肿瘤侵袭转移的作用，并导致结直肠癌淋巴结转移。

总之，本研究发现AQP-5参与了结直肠癌的淋巴结转移过程，其机制可能与AQP-5调控MMPs和TIMPs家族成员的表达及功能有关。AQP-5有可能成为抑制结直肠癌细胞生长及转移的新靶点，并可能作为结直肠癌的肿瘤标志物及预后因子。但本研究规模较小，还有待进一步深入研究，通过扩大研究规模、开展分子生物功能实验等方式阐明AQP-5与结直肠癌淋巴结转移的关系。

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3 Kasimir-Bauer S，Heubner M，Otterbach F，et al.Prognostic relevance of the AQP5-1364C＞A polymorphism in primary breast cancer.Mol Med Report，2009，2:645-650.

4 Kang SK，Chae YK，Woo J，et al.Role of human aquaporin 5 in colorectal carcinogenesis.Am J Pathol，2008，173:518-525.

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6 Yadav L，Puri N，Rastogi V，et al.Matrix metalloproteinases and cancerroles in threat and therapy.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15:1085-1091.

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8 Zhang T，Zhao C，Chen D，et al.Overexpression of AQP5 in cervical cancer:correlation with clinicopathological features and prognosis.Med Oncol，2012，29:1998-2004.

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Effect and action mechanism of AQP-5 on lymphatic metastasis of colorectal cancer

LV Bonan，SHI Xiaoming，WU Shengchun，et al.Department of General Surgery，Hebei，Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin-5(AQP-5)in colorectal cancer，and to analyze the relationship between AQP-5 expression and lymphatic metastasis as well as prognosis of patients.At the same time，to detect the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 in colorectal cancer in order to explore their significance.M ethodsThe paraffin specimens of 98 cases of colorectal cancer tissues with positive lymph nodes metastasis and 40 cases of tumor adjacent tissues were collected.The expression levels of AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins were detected by immunohistochemistry(SP)，moreover the patients’clinical data were recorded and the patients were followed up to analyze the correlation between AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins Results The expression levels of AQP-5，MMP-2，MMP-9 in tumor tissues were significantly higher than those in tumor adjacent tissues，however，the expression levels of TIMP-1，TIMP-2 in tumor tissues were significantly lower than those in tumor adjacent tissues(P＜0.05).The expression levels of AQP-5，MMP-2 were positively correlated to the numbers of lymph node metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival time in patients with positive AQP-5 was relatively shorter(P＜0.05).The AQP-5 was closely related with MMP-2，MMP-9，TIMP-1in colorectal cancer tissues(P＜0.05).ConclusionAQP-5 can promote lymph node metastasis of colorectal cancer，and positive AQP is a sign of poor prognosis.AQP-5 may regulate the expression of proliferation-related proteins to realize the effect.

colorectal cancer;aquaporin-5;metastasis，lymph node;prognosis;proteins related to invasion and metastasis

R 735.34

A

1002－7386(2015)03－0346－03

2014－06－11)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.006

050051石家庄市，河北省人民医院普外二科