脑创伤后Edaravone脑保护作用机制的实验研究

尹立国 崔建忠 高俊玲 赵雅宁

脑创伤后Edaravone脑保护作用机制的实验研究

尹立国 崔建忠 高俊玲 赵雅宁

目的:探讨Edaravone对脑创伤后保护作用的可能机制。方法采用改进的Marmarou’s法建立大鼠中度闭合性弥漫性颅脑损伤模型，应用TAB法、免疫组化，TUNEL法对大鼠伤后皮质自由基、细胞色素C及凋亡细胞数进行动态观察。结果伤后给予Edaravone能明显减少自由基水平，降低细胞色素c表达和神经元细胞凋亡数。结论Edaravone对颅脑创伤有治疗作用，其机制之一是通过减少自由基生成，抑制线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放，减少细胞色素c释放，进而减少神经细凋亡。

脑创伤;Edaravone;自由基;线粒体膜通透性转换孔;细胞色素c;凋亡

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)有较高的发生率，是导致创伤患者伤残及死亡的主要原因，严重危害人类健康，给社会和家庭带来沉重负担。Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是一种强力的自由基清除剂，能阻碍脂氧合酶代谢［1］并且在临床治疗急性脑缺血，取得良好效果［2，3］。但对其脑保护作用具体机制的研究笔者尚不多见，本研究运用改进的Marmarou方法建立大鼠弥漫性脑损伤型，证明脑创伤后Edaravone对脑保护作用的可能机制，以期为临床治疗提供理论依据和开拓新的治疗前景。

1 材料与方法

1.1 脑创伤模型的制备与分组健康雄性SD大鼠90只(体重300～350 g，购自北京维通力华公司，清洁级，自然光照，环境安静，温度适中，大鼠自由进食水，饲养1周后进行实验)随机分为对照组、颅脑创伤组、治疗组。每组设伤后1 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h 6个时相点。对照组每个时相点3只大鼠，创伤组和治疗组每个时相点6只大鼠。各组未达到规定时相点死亡的大鼠从实验中剔除。另取90只大鼠按相同的方法分组，用于丙二醛(MDA)测定。动物置乙醚麻醉缸中，以乙醚吸入方式深度麻醉动物，麻醉后的大鼠俯卧于落体致伤海绵垫上，70%乙醇消毒颅顶部皮肤，沿正中线矢状切开头皮，剥离骨膜，显露人字缝与冠状缝，将一不锈钢垫固定在大鼠冠状缝与人字缝之间将大鼠头部固定于打击模型架下的头部固定装置中，使重450 g，直径18 mm的铜柱沿垂直玻璃管于1.2 m高度自由落下，撞击大鼠颅骨顶部的钢垫，造成大鼠中度弥漫性颅脑损伤。撞击后即刻移开大鼠，以免铜柱反弹造成头部二次打击伤。给予颅脑损伤后大鼠，头皮切口常规消毒、缝合。对照组仅给予相同的麻醉处理及沿中线矢状切开头皮、剥离骨膜、在冠状缝与人字缝之间粘钢垫，置致伤海绵垫上，但不行自由落体致伤，而后常规消毒、缝合切口。3组未到规定时相死亡的大鼠予以剔除。

1.2 给药方法治疗组Edaravone 10 mg/kg，对照组、创伤组给予等量0.9%氯化钠溶液。注射方法为伤后10 min，尾静脉注射，每24小时注射1次。

1.3 标本检测

1.3.1 氧自由基中间产物MDA测定大鼠按伤后各时相点麻醉，迅速断头处死，取大脑皮质受损及周围区0.5 cm，在0℃用剪刀将组织剪碎成泥，冰上匀浆后按南京建成MDA检测说明书提供方法进行检测。

1.3.2 细胞色素c检测:标本甲醛固定，石蜡切片，按武汉博士德提供细胞色素c检测试剂盒说明书方法进行检测。

1.3.3 原位细胞凋亡检测(TUNEL法)按Roche公司提供TUNEL检测试剂盒进行操作。

1.3.4 阳性细胞免疫反应强弱:采用Motic Med 6.0计算机真彩色图象分析系统以平均光密度进行半定量分析。

1.4 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，多组间同一时间点及同一组中不同时间点比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧自由基检测结果伤后6 h即可检测到MDA升高，随着时间推移逐渐增高，与对照组相比较，24 h已显著升高(P＜0.01)，48 h达高峰。与创伤组比较，药物处理组在各时相点均明显降低，以24、48和72 h差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 大鼠脑创伤后大脑皮质自由基(MDA)水平动态变化nmol/mgpro，±s

表1 大鼠脑创伤后大脑皮质自由基(MDA)水平动态变化nmol/mgpro，±s

注:与对照组比较，*P＜0.01;与创伤组比较，#P＜0.01

组别伤后1 h伤后3 h伤后6 h伤后24 h伤后48 h伤后72 h对照组(n=18)4.55±0.12 4.50±0.12 4.56±0.11 4.52±0.17 4.50±0.11 4.38±0.19创伤组(n=36)4.56±0.11 4.57±0.15 4.74±0.14 5.74±0.15*7.66±0.16*6.37±0.11*治疗组(n=36)4.54±0.11 4.57±0.12 4.71±0.10 5.32±0.09*#6.24±0.05*#5.43±0.15*#

2.2 创伤组Ctyc免疫反应在伤后6 h即升高，伤后24 h达高峰，以后迅速下降，Edaravone治疗组与创伤组比较明显降低，在24 h、48 h、72 h差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2、图1～3。

表2 大脑创伤后大脑皮质cyt-c表达动态变化平均光密度值×10 000，±s

表2 大脑创伤后大脑皮质cyt-c表达动态变化平均光密度值×10 000，±s

注:与对照组比较，*P＜0.01;与创伤组比较，#P＜0.01

组别伤后1 h伤后3 h伤后6 h伤后24 h伤后48 h伤后72 h对照组(n=18)4.84±0.15 4.83±0.08 4.87±0.11 4.85±0.17 4.96±0.10 4.96±0.14创伤组(n=36)4.88±0.12 5.85±0.18*6.99±0.19*15.53±0.16*8.74±0.10*6.69±0.12*治疗组(n=36)4.81±0.09 5.88±0.13*6.80±0.18*13.54±.10*#6.76±0.13*#5.82±0.10*#

2.3 伤后1 h即可见少量凋亡细胞，以后凋亡细胞数逐渐增多，并于48 h达高峰，Edaravone明显降低脑创伤后大鼠大脑皮质神经细胞凋亡数，与创伤组比较在24 h、48 h、72 h差异有统计学意义(P＜0.01)。见表3，图4～6。

表3 大鼠脑创伤后大脑皮质神经凋亡数的动态变化±s

表3 大鼠脑创伤后大脑皮质神经凋亡数的动态变化±s

注:与对照组比较，*P＜0.01;与创伤组比较，#P＜0.01

组别伤后1 h伤后3 h伤后6 h伤后24 h伤后48 h伤后72 h对照组3.5±0.8 3.4±1.3 3.7±1.3 3.8±0.7 4.7±0.9 4.14±0.14创伤组40.4±4.6*54.2±3.2*64.2±2.5*90.8±1.9*106.0±5.2*93.56±3.06*治疗组38.5±2.4*53.9±2.6*63.0±2.2*#82.5±2.1*#94.1±2.1*#80.87±2.15*#

图1 对照组大鼠大脑皮质cyt-c表达(免疫组化×400)

图2 创伤24 h大鼠大脑皮质cyt-c表达(免疫组化× 400)

图3 给药24 h大鼠大脑皮质cyt-c表达(免疫组化× 400)

图5 创伤后48 h大鼠大脑皮质(TUNEL染色×400)

图4 对照组大鼠大脑皮质(TUNEL染色×400)

图6 给药48 h大鼠大脑皮质(TUNEL染色×400)

3 讨论

生理状态下，机体自由基的产生与清除间保持着动态平衡。脑创伤后，线粒体在导致组织组织损伤的分子事件中起到关键性作用，由于颅内压增高，血管痉挛及呼吸紊乱等，产生能量代谢障碍，由线粒体呼吸链和胞浆酶系(如黄嘌呤氧化酶)产生大量自由基，导致氧化应激。Crompton［4］论述了ROS的形成增多导致PTP开放。线粒体膜通透性转换孔(PTP)开放后可导致细胞坏死和凋亡［4－6］。Lewen等［7］也认为TBI后氧自由基产生增加可以导致线粒体功能紊乱，增加的氧自由基与钙离子相互作用导致线粒体膜渗透性转换孔开放，细胞色素c从损坏的线粒体释放，通过caspase依赖方式，诱导细胞凋亡。

Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是2001年开发上市的神经元保护剂和具有捕获羟自由基的活性抗氧化剂。顾学兰等［8］研究结果表明Edaravone注射液能有效减轻脑出血后神经功能缺损症状和出血后继发性缺血性损伤。在大鼠局灶脑缺血模型中，Edaravone能明显减轻脑缺血，减少脑梗死面积。作用机制可能是抑制主要包括自由基和脂质过氧化物在内的脂氧化酶［9］。该药主要用于治疗急性脑梗死，但关于脑创伤的研究鲜有报道，本研究应用Marmarou脑创伤模型，研究Edaravone对脑创伤的保护作用。本试验中，Edaravone能显著降低各时段代表自由基含量的MDA水平，还降低了由线粒体释放的Cytc的表达并减少脑创伤后的神经细胞凋亡数量，说明脑创伤后Edaravone有明显的脑保护作用，其机制之一是通过减少自由基生成，通过线粒体释放Cytc的某个环节而发挥其脑保护作用。一项关于心肌缺血再灌注的实验证明Edaravone能作用于MPTP，有效地减少缺血再灌注损伤引起的心肌梗死面积和心肌细胞凋亡以及线粒体的肿胀程度［10］。既然自由基能作用于线粒体膜渗透性转换孔，使其开放引起细胞释放细胞色素c，引起细胞凋亡，而Edaravone是一种强力的自由基清除剂，减少代表PTP功能状态的Cytc的表达进而减少细胞凋亡。结合本实验数据，可以肯定脑创伤后Edaravone对脑保护的作用机制之一是通过限制线粒体渗透性转换孔开放减少细胞色素c释放而起作用的。

1 Murota S，Morita I，Suda N.The control of vascular endothelial injury.ANN NY Acad Sci，1990，598:182-187.

2 Houki K，Nakayama N，Kamada K，et al.Neuroprotective effects of the free radical scavenger MCI-186 in patients with cerebral infarction:clinical evaluation using magnetic resonance imaging and spectroscopy.J Stroke Cerebrovasc Dis，1998，7:315-322.

3 Mitsumori K，Sakuragi M，Kitami K，et al.The effect of MCI-186 on regional cerebral blood flow in patients with acute cerebral infarction.Therapeut Res，1998，19:553-565.

4 Crompton M.The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death.Biochem J，1999，341:233-249.

5 Halestrap AP.The mitochondrial perbmeability transition:its molecular mechanism and role in reperfusion injury.Biochem Soc Symp，1999，66: 181-203.

6 Halestrap AP，Kerr PM，Javadov S，et al.Eluciting the molecular mechanism of the heart.Biophys Acta，1998，1366:79-94.

7 Lenwen A，Fujimura M，Sugawara T，et al.Oxidative stress-depend release of mitochondrial cytochorome c after traumatic brain injury.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21:914-920.

8 顾学兰，高艳坤，孙涛，等.依达拉奉对脑出血大鼠神经行为学、脑缺血面积及出血最的影响.中国新药与临床杂志，2006，25:361-385.

9 Tanaka M.Pharmacological and clinical profile of the free radical scavenger edaravone as a neuroprotective agent.Nippon Yakurigaku Zasshi，2002，119:301.

10 Rajesh KG，Sasaguri S，Suzuki R，et al.Antioxidant MCI-186 inhibits mitochondrial permeability transition pore and upregulates Bcl-2 expression.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285:H2171-H2178.

Experimental study of the protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury

YIN Liguo*，CUI Jianzhong，GAO Junling，et al.*Department of Neurosurgery，Zunhua City People’s Hospital，Hebei，Zunhua 064200，China

ObjectiveTo investigate the possible action mechanism of protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury.M ethodsThe middle degree closed diffused craniocerebral injury models in rats were established by improved Marmarou＇s method.After the models were successfully established，the free radical in cortex of the rats，Cyt-c and apoptosis cell numbers were detected and observed dynamically by TAB，immunohistochemry，TUNEL，respectively.ResultsEdaravone could decrease obviously the levels of free radical，the expression of Cyt-c and apoptosis nerve cells after traumatic brain injury Conclusion Edaravone is effective in treating traumatic brain injury，and one of action mechanisms is to reduce generation of free radical，inhibit opening of mitochondrial permeability transition pore(MPTP)，reduce releasing of Cytc，and then decrease nerve cell apoptosis.

traumatic brain injury;Edaravone;free radical;mitochondrial permeability transition pore;Cytc;apoptosis

R 749.12

A

1002－7386(2015)03－0353－03

2014－09－21)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.008

064200河北省遵化市人民医院(尹立国);河北省唐山市工人医院(崔建忠);河北联合大学(高俊玲、赵雅宁)

崔建忠，063000河北省唐山市工人医院; E-mail:JZHC01@hotmail.com