抗绿脓杆菌活性物质的筛选及有效成分研究

翟俊伟 刘晓荣

·论著·

抗绿脓杆菌活性物质的筛选及有效成分研究

翟俊伟 刘晓荣

目的从众多微生物中找到能够对抗绿脓杆菌的活性物质，分析其成分并分离鉴定，找到更有效的抗绿脓杆菌，为临床医学研究提供帮助。方法选取唐山市丰南区医院花园土进行细菌培养，通过各项研究筛选微生物，并对抗绿脓杆菌的活性成分表达条件不断优化，研究不同环境下酸碱值、培养基、时间以及温度条件下比较其活性成分，从而得出适合的发酵条件。收集发酵液，采用离子交换、硫酸铵沉淀、分子筛等方式将蛋白纯化。测定抗绿脓杆菌活性成分的敏感性、稳定性、分子量等。结果从研究的土壤中筛选出了5种菌群，经过革兰氏染色、菌落形态、RDP序列分析等操作，分析了菌株的不动细菌数以及假单胞菌属。结论拮抗绿脓杆菌的活性成分分析研究显示，活性成分不适宜在高温下存活，且容易被蛋白酶K水解，分子量大约在35 kD左右，属于抗菌蛋白。

绿脓杆菌;活性物质;表达条件;菌落形态，发酵

绿脓杆菌能产生多种致病物质，主要是内毒素、外毒素、蛋白分解酶和杀白组胞素等。其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力降低时，如大面积烧伤，长期使用免疫抑制剂等。临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等［1，2］。应用抗绿脓杆菌免疫力血清可降低患者继发败血症的发生率和病死率［3］。因此研究对绿脓杆菌的抗体并分析其成分具有较高临床意义。本次研究基于这一背景，采用实验检验方式，从最初的试剂、设备准备开始，针对抗绿脓杆菌活性物质展开筛选并研究其成分，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂本次研究由于研究重点在于绿脓杆菌方面，因此应注意实验准备工作以及相关药剂的设定，具体而言，可分为培养基的准备、实验菌种的培养、土壤样品的选取、主要实验试剂的准备以及实验需要仪器的安排等，具体如下:

1.1.1 培养基的准备［4-6］:培养基主要有发酵培养基与LB培养基两种。发酵培养基的制备包含1 000 ml蒸馏水、5 g氯化钠、3 g葡萄糖、5 g胰蛋白胨以及3 g酵母膏，将发酵培养基的酸碱值控制在7.2～7.4，制备完成后将培养基放在121℃的高温环境中半小时来高压、高温灭菌。LB培养基的制备包含1 000 ml蒸馏水、10 g氯化钠、5 g酵母膏以及10 g胰蛋白胨，同样将制备好的培养基酸碱值调节到7.2～7.4，放在121℃的高压、高温环境中灭菌0.5 h。除上述两种培养基外，还应制备复筛培养基以及固体培养基。复筛培养基的制备主要是在蒸馏水中加入浓度为5%的氯化钠溶液、2.5%的酵母膏以及5%的胰蛋白胨。固体培养基的制备方面，主要为抑菌作用并让其处于相对黏稠状态，因此在制备上需加入一定量的琼脂，具体而言，需在蒸馏水中加入浓度为2.5%的氯化钠溶液，1.3%的酵母膏以及2.5%的胰蛋白胨，同时将1%琼脂加入其中。上述两种培养基均将酸碱值调整至7.2～7.4，并放置在高温高压(121℃)环境中0.5 h，将制备中可能产生的细菌消灭。

1.1.2 实验菌种的培养:本次研究中实验菌种主要有两种，即指示菌以及供试菌。指示菌为PA01，由医院本身研究提供。供试菌为B2002、B2001、B1506、B1505、B1503.

1.1.3 土壤样品的选取:研究中使用的土壤为正常土壤，主要取自我院花坛中土壤。取样之后将土壤按照重量分类(保障土壤成分均匀，并且取自同一范围)，有效编号。

1.1.4 主要实验试剂的准备:实验试剂包含两性电解质、宽分子量蛋白以及试剂盒。其中试剂盒为上海华舜公司(生物技术)生产，用于抽提注释小量细菌的DNA基因组。

1.1.5 实验需要仪器的安排:对绿脓杆菌的研究需要的仪器较多，涉及到灭菌、观察、培养等各项操作，因此在仪器准备方面如下:上海尤尼柯公司生产的紫外可见分光光度计、上海申安医疗公司生产的灭菌锅、北京六一仪器公司生产的电泳仪、常规显微镜、冷冻离心机、常州国华公司生产的恒温培养振荡器、上海精宏实验公司生产的生化培养箱以及苏州泰安空气技术公司生产的洁净工作台。上述仪器为本次研究时使用到的主要仪器。

1.2 方法绿脓杆菌实验涉及到其耐药性研究以及外膜通透性研究，因此在试验方法上首先应进行绿脓杆菌的筛选与培养，其次将其菌株进行分离研究，之后鉴定其菌株状态，便可开始对其活性成分的条件表达、成分纯化以及成分特征展开研究。

1.2.1 拮抗绿脓杆菌的筛选与培养:之前提到，土壤的选取是在我院花坛中选取，在土壤采集之后，需要将其放在4℃的环境中妥善保存，以免影响到培养效果。在拮抗绿脓杆菌的筛选方面，本次研究采用的是“双层平板法”。首先制作下层部分，将出筛培养基与指示菌(研究中的指示菌为绿脓杆菌)混合均匀，使之成为下层培养基。上层部分的制作方面，首先应将已经妥善保存的土壤研磨充分，之后实施梯度稀释，取土壤悬液1 ml倒入之前已经做好的下层培养基上。制作完成后，需将营养琼脂培养基倒入(需注意此培养基倒入时的温度需保持在50℃)，在充分混合后上层培养基制作完成。整体的培养基需要放置在保持37℃的环境中，同时做好日观察记录［7，8］。

1.2.2 拮抗绿脓杆菌的菌株分离:当制备好的培养基上已经产生菌落时，可用牙签(经过灭菌处理)将初筛双层平板上已经出现的透明圈菌落挑起部分，实施划线分离操作。将单一菌落挑取出来，用点接方式将其放在验证版(含有绿脓杆菌)上面，并在37℃环境中静置培养3 d。3 d后观察验证版上是否已经出现了透明圈，若出现则注意观察产圈是否呈稳定状态。对于呈稳定性的产圈，其菌株应进一步展开纯化操作并妥善保存，以备后续试验研究。

1.2.2.1 抑菌活性测试［9，10］:①首先在直径为100 mm的指示平板上将抑菌平板固体培养基(温度为50℃，剂量为50 ml)加入，静置存放直至其完全冷却。冷却之后将绿脓杆菌菌悬液(剂量为100 μl，浓度为OD600=0.2)均匀的涂抹在培养基上。②之后进行抑菌活性测定，本次研究采用的是打孔扩散法。使用打孔器将指示平板上打孔，孔直径约在9 mm左右。通过已经打好的孔注入发酵上清液约300 μl，在37℃的恒温下培育24 h。之后观察打孔周边抑菌圈状态，主要观察其大小，将透明圈的直径测量并记录。

1.2.2.2 菌株的重复筛选:首先应将适合的菌株实施发酵，选取通过分离找出的带有拮抗绿脓杆菌能力的菌株，将其采用摇瓶方式发酵。使用之前制备好的复筛培养基，将其接种于锥形瓶中(锥形瓶中装液量控制在100 ml/250 ml)，接种量在0.01，将其放在37℃环境中，使用250 r/min摇振培养。实验过程中，每隔12 h需观察发酵液状态，8 000 r/min摇振离心10 min，将菌体去除。抑菌活性的测定采用打孔扩散法，观察菌体状态以及透明圈直径并严格记录。菌株筛选方面，选取对绿脓杆菌存在抑菌作用的且抑菌圈相对较大的菌株。③之后排出发酵液中其他影响，主要为酸碱作用影响。在培养24 h之后，测定发酵液的酸碱值，并对比实验研究前发酵液的酸碱值。实验前酸碱值已经在培养基制备时保持在了7.2～7.4，因此若产生变化便可得出在发酵过程中菌株是否会产生有机酸或是有机减。④最后实施蛋白酶的处理。将蛋白酶K配置成为溶液状态，比例为每毫升含5 mg。在ep管中放入0.1 ml蛋白酶K溶液，同时将0.4 ml发酵液放入其中，让其最终浓度保持在1 mg/ml。将溶液酸碱值调节到7.0左右。与此同时，需要在0.4 ml发酵液中加入0.1 ml的双蒸水，以此作为对照研究。将2组处理放在37℃环境中0.5 h，观察发酵上清液在抑菌活性上的变化，并将抑菌圈出现缩小趋势的菌株筛选出来备用。

1.2.3 菌株的鉴定:首先对拮抗绿脓杆菌实施形态学鉴定。选取已经培养了24 h以上的菌株，采用革兰氏染色法，利用显微镜观察菌体状态，包含形状以及颜色等基本方面。将选取的菌株划线培养(在营养琼脂平板上面)，之后观察菌落变化情况。DNA染色体的提取:首先选取1 ml细菌培养液，采用12 000 r/min离心1 min，之后尽可能将上清部分吸尽，以免影响到研究准确性。想衬垫的细菌中加进溶液A 200 μl，充分振荡，让菌体保持在充分悬浮状态，将每毫升200 μl的RNaseA选取200 μl加入，保持在37℃的环境中静置30 min。将每毫升10 mg的蛋白酶K 20 μl加入到管中，充分混合之后静置在55℃环境中1 h，期间应将试管颠倒数次保障样品消化完全，也就是液体变得黏稠、清亮。将溶液B加入试管中200 μl，充分混合之后至溶液清亮。在管中加入无水乙醇200 μl，混合均匀之后观察试管，此时可能存在絮状物的沉淀，属于正常现象，不会影响DNA提取，处理上可将沉淀物与溶液均加入吸附柱，静置2 min。选取12 000 r/min离心1 min，加入漂洗液500～700 μl，将废弃液丢掉之后将吸附柱放入收集管。

2 结果

2.1 拮抗绿脓杆菌分离菌形态研究根据本次研究结果不难发现，不同菌株在特征上不尽相同，本次研究共研究了5种菌株，大部分为短杆菌，只有编号为B1506的菌株为杆菌。菌体直径方面，B1506的菌株直径最小，B2002菌体直径最大。见表1。

2.2 RDP研究本次研究测定了5种菌株的同源性、相似度最高菌株以及RDB分析，结果显示，B1506菌株同源性达到了100%，其余4种同源性为99%。且B1506与B1505为不动杆菌属，其余3项为假单胞菌属。见表2。

表1 菌体形态研究表

表2 RDP测定结果表

3 讨论

绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质，如内毒素、外毒素a、弹性蛋白酶、胶原酶、胰肽酶等，其中以外毒素a最为重要。外毒素a机制与白喉毒素有些类似，即最终使核糖体上延长因子2(ef～2)失活，抑制宿主细胞的蛋白质合成，但具体过程不同。此外，外毒素a和白喉毒素在蛋白质结构、免疫原性、鞭细胞和敏感动物等方面均有差异［11］。

3.1 活性物质筛选通过本次研究，了解到抗绿脓杆菌在活性物质筛选方面，土壤是微生物发育、成长的必须环境，此处微生物种类繁多，且较为集中，数量也比较大，因此土壤可以说是具有丰富菌种的微生物资源库，对于拮抗绿脓杆菌的筛选可能性较大。研究选择的琼脂扩散法操作上较为简单，将抑菌物质涂抹在指示板上，经过时间以及温度影响让其扩散后会形成抑菌区域，此区域浓度较稳定，对微生物生长起到抑制作用并呈现出透明状，抑菌圈的大小能够起到判断抑菌物质效果、强弱的作用。研究发现，在确定发酵成分为抗菌蛋白或是抗菌肽之前，应将发酵液中的碱成分以及酸成分排除，减少其对绿脓杆菌的影响。对酸碱值的测定加上蛋白酶处理能够确定最后分离物质是蛋白类还是肽类。

3.2 鉴定菌种本次研究由于条件限制，在DNA杂交试验方面存在限制条件，因此是结合了序列分析来研究菌株形态的。鉴定结果显示，B1506与B1505为不动杆菌属，其余三项均属于假单胞杆菌。其中由于B1505的细胞壁相对于其他几种而言较厚，因此采用常规方式破壁并不能有有效将其细胞壁破坏，因此在基因组的提取方面难度相对较大，研究采用的是溶菌酶处理方式，在36 h之后将其溶解。由此可见，这类型细胞壁组织具有与其他4种不同的特殊性。且后续研究发现，其同源性达到了99%，很可能成为一种新的菌株。

3.3 发酵条件研究中使用的培养基初始酸碱值在7.2～7.4，这对抗菌肽的影响比较大，菌株不同，其成长需要的酸碱环境也不尽相同。本实验中培养基起始pH值对抗菌肽的也很大，在初始酸碱为7.0～8.0时，B1505发酵液的抑菌活性较高，而其他酸碱值下抑菌活性明显降低，说明培养基的初始酸碱值在发酵过程中对抗菌肽的产生具有重要作用。刚从普通土壤中分离得到的B1505发酵产量相对偏低，菌种生长较为缓慢，原因方面:(1)可能是自然条件下(普通土壤)相关基因表达量低，(2)培养条件也是影响发酵的重要因素。为了提高发酵产物的产量，我们对其进行了发酵条件优化试验。培养基是进行发酵优化的重要方面，不同的微生物生长及发酵过程需要的培养基不同，且培养基对发酵产物的影响是至关重要的。由于采用小试摇瓶培养，重要目的是发现并纯化发酵产物，所以产量相对较高足以进行后续实验为标准［12］。

综上所述，本次研究中针对5种菌株展开研究，经过革兰氏染色、DNA提取等操作研究了菌落形态等，将其分为了不动杆菌属以及假单胞菌属。研究表明，抗绿脓杆菌的活性成分不易存放在高温环境中，易被蛋白酶K水解，是一种抗菌蛋白。

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R 378.91

A

1002-7386(2015)02-0206-03

2014-10-22)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．015

063300河北省唐山市丰南区医院检验科