通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜组织LN和FN表达的影响

刘敏 王超 邢邯英 王杏

·论著·

通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜组织LN和FN表达的影响

刘敏 王超 邢邯英 王杏

目的探讨通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜组织纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)表达的影响。方法40只KK/Upj-Ay小鼠分为模型组与通心络高、中、低剂量(4、2、1 g/kg)组，每组10只，灌胃途径给药，持续12周;另取10只C57BL/6小鼠作正常对照组。应用RT-PCR法检测各组小鼠视网膜组织中FN、LN的mRNA表达; Western blot法检测视网膜组织中FN、LN蛋白的表达。结果与对照组相比，模型组小鼠视网膜组织LN、FN mRNA和蛋白表达均明显增高(P＜0.05)，通心络低、中、高各剂量组LN、FN mRNA和蛋白表达水平均较模型组明显下降(P＜0.05)。结论通心络胶囊可通过抑制糖尿病小鼠视网膜组织LN、FN的表达从而改善视网膜病变。

通心络胶囊;糖尿病视网膜病变;纤维粘连蛋白;层粘连蛋白

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)目前是主要的致盲原因之一［1］，也是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一。糖尿病视网膜病变基本的病理改变为毛细血管内皮细胞增生、基底膜增厚、内皮细胞损伤、通透性增加、新生血管形成和纤维组织化［2］。基底膜为细胞外基质的存在方式之一，层粘连蛋白(LN)和纤维粘连蛋白(FN)是细胞外基质(ECM)的主要成分，其主要功能是介导细胞间的黏附、增殖、迁移及分化等过程［3］。本实验应用KK/Upj-Ay自发性2型糖尿病小鼠模型，观察通心络胶囊对糖尿病视网膜组织LN、FN表达的影响，进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF清洁级KK/Upj-Ay糖尿病小鼠40只，体重30～40 g;SPF清洁级C57BL/6小鼠，体重25～30 g，均为雄性，12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号:SCXK-(京)2009-0002。

1.2 药品与试剂通心络胶囊购于石家庄以岭药业股份有限公司，层粘连蛋白(FN)、纤维粘连蛋白(LN)抗体均购于abcam公司。

1.3 实验分组与给药KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值(FBG)随机分为模型组、通心络高剂量组、通心络中剂量组、通心络低剂量组，对照组使用C57BL/6小鼠，每组均为10只。通心络高、中、低剂量组分别给予生药量4、2、1 g/kg的通心络胶囊，对照组和模型组分别给予等体积的蒸馏水，每组均采用灌胃途径给药，1次/d，连续给药3个月。

1.4 Real Time PCR(qPCR)方法测定FN、LN mRNA的表达取小鼠眼球，仔细分离视网膜组织，常规方法提取RNA，进行qPCR扩增，以GAPDH作为内参照。GAPDH引物:上游5＇-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3＇，下游5＇-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3＇，产物片段143 bp;FN引物:上游5＇-GGAGAACCAGGAGAGCACAC-3＇，下游5＇-CACAAACTGTAGGTCCGTCG-3＇，产物片段97 bp;LN引物:上游5＇-AAGGGCTTTGGGATGTCAT-3＇，下游5＇-CGAGTCCAGTTCAGCGTGA-3＇，产物片段88 bp;实验结果与对照组进行比较后的相对值记为最终结果，对照组设置为1。

1.5 Western blot法检测FN、LN蛋白的表达取视网膜组织，低温储存，常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1.6 统计学分析应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，两两比较应用S-N-K法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜FN、LN mRNA表达变化与对照组比较，模型组小鼠视网膜组织LN mRNA表达明显增高(P＜0.05);通心络低、中、高各剂量组LN mRNA表达水平均较模型组明显下降(P＜0.05)，随着剂量的增加LN的表达逐渐下降，各组之间互相比较差异均具有显著性(P＜0.05)。与对照组相比，模型组小鼠视网膜组织FN mRNA表达明显升高(P＜0.05);而低、中、高剂量组FN mRNA表达水平均较模型组明显降低(P＜0.05)，而高剂量组较中、低剂量组的表达下调更为明显(P＜0.05)。见表1。

表1 5组视网膜LN、FN mRNA表达比较n=10，±s

表1 5组视网膜LN、FN mRNA表达比较n=10，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与通心络高剂量组比较，△P＜0.05

组别LNFN对照组1.12±0.151.02±0.09模型组5.21±0.53*4.02±0.48*#通心络低剂量组4.13±0.29*#3.49±0.39*#△通心络中剂量组3.07±0.33*#3.17±0.30*#△通心络高剂量组2.63±0.22*#2.39±0.26*#F值110.32262.199 P值0.0000.000

2.2 视网膜FN、LN蛋白的表达变化Western blot结果显示模型组小鼠视网膜FN、LN蛋白表达均明显高于对照组(P＜0.05);与模型组比较，通心络各剂量组FN、LN蛋白表达均显著下降(P＜0.05)。见表2，图1。

3 讨论

DR是一种世界性的致盲眼病，是糖尿病患者的主要并发症之一，高血糖是DR视网膜损伤的重要始发因素［4］。持续性的高血糖状态可以诱发包括蛋白激酶C激活、氧化应激、氨基己糖通路活性增高等一系列代谢异常，诱发一系列复杂的级联反应造成视网膜循环障碍［5］，使周围毛细血管内皮细胞失去调节能力，毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，进而造成毛细血管的阻塞引起周围组织缺血水肿，伴微血栓形成甚至血管闭塞［6］。视网膜微血管闭塞性改变，属中医“络病”范畴，临床用药清除瘀血，通其血脉，偏重治络，药物选择应在整体辨证的基础上，加上辛味药和虫类药的应用，以达到扶正及祛邪通络的目的［7］。通心络是一种由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕、赤芍等组成的中药复方制剂;有研究表明，其可改善糖尿病患者视网膜微循环，减轻视网膜及黄斑水肿，疗效确切［8］。

表2 5组视网膜LN、FN蛋白表达比较n=10，±s

表2 5组视网膜LN、FN蛋白表达比较n=10，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05;与通心络高剂量组比较，△P＜0.05

组别LNFN对照组0.16±0.030.19±0.04模型组0.74±0.06*0.72±0.06*通心络低剂量组0.35±0.05*#0.39±0.06*#△通心络中剂量组0.32±0.04*#0.37±0.05*#△通心络高剂量组0.23±0.03*#0.28±0.03*#F值137.06684.350 P值0.0000.000

图1 5组Western blot结果

随着对细胞外基质(ECM)的分子结构和功能的研究，发现ECM在DR发生中具有重要的作用，已引起中外学者的关注［9］。FN、LN是ECM大家族中的重要成员，是构成基底膜的主要成分，FN可以与细胞外基质各类成分相结合，并促进细胞外基质其他成分的沉积;LN则可以引起细胞黏附并影响基底膜的电荷选择性，导致毛细血管通透性改变，加重视网膜损伤［10］。因此，FN、LN作为细胞与间质相互作用的桥梁，在DR的发生发展中起着重要作用。

本实验观察通络药物通心络胶囊对自发性2型糖尿病小鼠(KK/Upj-Ay小鼠)视网膜病变的影响。结果显示模型组小鼠视网膜组织FN、LN的表达与对照组比较显著升高(P＜0.05)，给予通心络灌胃治疗后，通心络高、中、低剂量组小鼠视网膜组织FN、LN的表达明显减少(P＜0.05)，提示通心络胶囊可通过抑制糖尿病小鼠视网膜组织FN、LN的合成，缓解糖尿病视网膜病变，为中医治疗DR提供了理论依据。

1王蕾蕾，王宁，冯奕斌，等.中医药治疗糖尿病视网膜病变临床与基础研究进展.中国中医眼科杂志，2014，24:227-232.

2Scanlon Peter H.Diabetic retinopathy.Medicine，2010，38:656-660.

3潘琳，李光伟，周水平，等.细胞外基质纤维连接蛋白和层粘连蛋白在糖尿病大鼠视网膜微血管病变表达的研究.中华糖尿病杂志，2004，12:56-59.

4Choudhuri S，Dutta D，Sen A，et al.Role of N-?-carboxy methyl lysine，advanced glycation end products and reactive oxygen species for the development of nonproliferative and proliferative retinopathy in type 2 diabetes mellitus.Mol Vis，2013，19:100-113.

5陈霞琳，汪迎，张凯，等.糖尿病性视网膜病变相关危险因素分析.临床眼科杂志，2013，21:320-322.

6赵凌军.中西医结合治疗糖尿病视网膜病变的临床效果分析.中国实用医药，2014，9:165-166.

7郭承伟，张宏国，马栋.从络论治糖尿病视网膜病变的理论与应用探讨.中国中医眼科杂志，2011，21:255-257.

8孟宪民，张书申，段永畅.通心络胶囊联合激光治疗糖尿病性视网膜病变的观察.医药论坛杂志，2011，32:155-156.

9Kowluru RA，Tang J，Kern TS.Abnormalities of retinal metabolism in diabetes and experimental galactosemia.VII.Effect of long-term administration of antioxidants on the development of retinopathy.Diabetes，2001，50:1938-1942.

10苑维，金明，潘琳，等.红参对糖尿病大鼠视网膜微血管病变细胞外基质的影响.中国中医眼科杂志，2004，14:200-203.

Effects of Tongxinluo capsule on the expression of FN and LN in retina of diabetic mice

LIU Min，WANG Chao，XING

Hanying，et al．Hebei Provincial Geriatric Key Laboratory，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo explore the effect of Tongxinluo capsule on the expression of fibronectin(FN)and laminin (LN)in retina of KK/Upj-Ay mice.MethodsForty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into 4 groups:model group，Tongxinluo low-dose group(1g/kg)，median-dose group(2g/kg)，high-dose(4g/kg)group.The mice were given medicines intragastrically once a day for consecutive 12 weeks.The other 10 C57BL/6 mice were enrolled as control group.The expression levels of FN and LN mRNA in retina were detected by Real time PCR，and the contents of protein were determined by Western blotting.ResultsAs compared with those in control group，the expression levels of LN，FN mRNA and protein in retina in model group were significantly increased(P＜0.05)，however，which in Tongxinluo low-dose group，median-dose group，high-dose group were significantly decreased，as compared with those in model group(P＜0.05).Conclusion

Tongxinluo capsule may improve diabetic retinopathy by inhibiting the expression of LN and FN in retina tissue of diabetic mice.

Tongxinluo capsule;diabetic retinopathy;fibronectin;laminin

R 587.2

A

1002-7386(2015)02-0174-03

2014-09-22)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．003

项目来源:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(编号: 2012GB518606)

050051石家庄市，河北省人民医院老年医学重点实验室