人鼻咽癌放射抗拒性肿瘤干细胞的分离、筛选与鉴定

王亚利，王中卫，任洪涛，金迎迎，李 毅

（西安交通大学医学部第二附属医院肿瘤科放疗中心，陕西西安 710004）

人鼻咽癌放射抗拒性肿瘤干细胞的分离、筛选与鉴定

王亚利，王中卫，任洪涛，金迎迎，李 毅

（西安交通大学医学部第二附属医院肿瘤科放疗中心，陕西西安 710004）

目的 分离、筛选、鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的肿瘤干细胞。方法 免疫磁珠技术分选CNE-2及CNE-2R中鼻咽癌CD133+干细胞，分别用无血清培养法、平板克隆法、裸鼠成瘤试验检测分选的CD133+细胞体外增殖能力、克隆形成能力及成瘤能力，HE染色和电镜超微结构观察形态学变化。结果 CNE-2及CNE-2R细胞中CD133+表达分别为（1.79±0.16）%和（2.63±0.72）%；CNE-2-CD133+细胞及CNE-2R-CD133+细胞形成肿瘤干细胞球及体外增殖能力远高于CD133-表达者；CNE-2R-CD133+细胞克隆形成能力较CNE-2-CD133+细胞明显升高，而且CNE-2R-CD133+细胞的克隆形态与CNE-2-CD133+细胞相比较明显增大；形态学发现CNE-2R-CD133+细胞核大，异型，核仁大，细胞器肥大。结论 分离、筛选出的鼻咽CNE-2R-CD133+肿瘤干细胞能形成干细胞球，其增殖能力、裸鼠成瘤能力更强，能为进一步探讨鼻咽癌放射抗拒的机制提供研究基础。

鼻咽癌；放射抗拒性；肿瘤干细胞

肿瘤干细胞是一种极少数的增殖特性失控、可形成肿瘤、具有干细胞特性的肿瘤细胞。是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤增长、复发及转移的根源［1］。肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）的存在被认为是鼻咽癌局部复发及放射治疗失败的关键原因［2］。我们在前期已经成功在人鼻咽癌细胞株CNE-2基础上建立放射抗拒性人鼻咽癌细胞株CNE-2R，并对鼻咽癌放射抗拒性在基因组学及蛋白组学方面作了初步探讨。本研究用免疫磁珠法分离、筛选鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的CD133+细胞，并对其干细胞特性通过裸鼠成瘤实验、电镜超微结构观察及特异性蛋白表达等试验予以验证。为进一步探讨鼻咽癌放射抗拒的机制，阐明其分子调控途径和基因表达谱，为调控鼻咽癌的放射治疗敏感性提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养CNE-2及放射耐受CNE-2R培养于100 m L/L胎牛血清、30 m L/L谷氨酰胺的DMEM/E12（Gibco）培养基，50 m L/L CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养。

1.2 分离、筛选鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的肿瘤干细胞

1.2.1 免疫磁珠技术分选CNE-2及CNE-2R细胞株的CD133+细胞 按照说用明书操作，取指数生长期的CNE-2和CNE-2R制成单细胞悬液，进行CD133/2（293C3）-PE标记，加入包被有鼠抗人CD133抗体的磁珠，4℃，孵育30 min。通过磁珠分选柱分别收获CD133-和CD133+细胞。将所收获的CD133+和CD133-细胞，加入无血清培养基置于50 m L/L CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养。

1.2.2 检测CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+干细胞体外成球及增殖能力 ①干细胞体外成球能力。取分选的CD133+细胞和CD133-细胞在无血清培养液中，37℃、50 m L/L CO2饱和温度的培养箱中培养，每天加入0.25 m L无血清培养液，观察肿瘤细胞克隆球形成过程，倒置显微镜观察。②CD133+干细胞体外增殖能力。将分选的CD133+细胞，CD133-细胞以及未分选的细胞种植于96孔板内，每孔加入0.2 mL无血清培养液，无血清培养液含DMEM/E12（1∶1）、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bEGE）、20μg/L表皮生长因子（EGE）、5 mg/L胰岛素的无血清培养液，2 000细胞/孔。置于37℃、体积分数50 mL/L CO2饱和温度的培养箱中培养，在培养第1、3、5、7天测定细胞的增殖状态，以490 nm吸光度（A）值检测存活活细胞数，每组所得数据取均值，绘制细胞生长曲线、比较各组细胞的增殖速度。

1.2.3 体外平板克隆形成实验检测CD133+干细胞克隆形成能力 将分选的CD133+及CD133-细胞进行细胞计数，以每200个细胞接种于含10 m L上述无血清培养液的6孔板中，置于37℃、体积分数50 m L/L CO2饱和温度的培养箱中培养3周。当6孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养液，纯甲醇固定15 min。结晶紫室温固定15 min。洗去染料后显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，然后计算克隆形成率。实验重复3次。克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.4 裸鼠成瘤试验 收集CNE-2-CD133-、CNE-2-CD133+、CNE-2R-CD133-、CNE-2R-CD133+各组细胞，冰预冷的PBS重悬，调整细胞浓度为1×104/μL。碘伏消毒后分别向裸鼠背部皮下注射CD133+和CD133-细胞0.2 m L。裸鼠饲养于高度洁净无特殊病原体（specific pathogen free，SPE）无菌净化室内。每周观察1次，4周后处死，测量肿瘤大小，照相。

1.2.5 HE染色和电镜超微结构观察 取新鲜瘤组织剪碎，常规甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片。苏木素染色，流水冲洗。伊红染色，自来水冲洗。脱水，透明，中性树胶封片。新鲜预冷的25 g/L戊二醛4℃固定新鲜瘤组织72 h，PBS漂洗4次，每次30 min；10 g/L锇酸避光固定2 h；50%、70%、90%，100%丙酮梯度脱水各15 min；纯丙酮：树脂（1∶1）浸透1 h，纯丙酮：树脂（1∶2）浸透2 h，纯树脂过夜。胶囊内包埋后72℃烤箱聚合10 h。醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。

2 结 果

2.1 CD133+的表达率流式细胞分析结果显示CNE-2及CNE-2R细胞中CD133+表达率分别为（1.79±0.16）%和（2.63±0.72）%，二者差异显著（P＜0.05，图1）。

2.2 CNE-2及CNE-2R CD133+肿瘤干细胞球的形成CNE-2及CNE-2R CD133+细胞在无血清条件下悬浮生长，培养12 d后开始形成干细胞球，球体大小不一（图2）。CNE-2-CD133+细胞及CNE-2RCD133+细胞形成肿瘤干细胞球的能力远高于CD133-表达者。

2.3 CD133+干细胞的体外增殖能力各组细胞照射24 h后，与未分选细胞相比，CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+细胞增长幅度均大于CD133-（P＜0.05）。其中CNE-2R-CD133+组的细胞增长幅度最大（表1）。

图1 流式细胞检测CD133+在鼻咽癌CNE-2及CNE-2R中的表达分别为1.79%和2.63%Eig.1 Expression of CD133+in NPC cells of CNE-2 and CNE-2R was 1.79%and 2.63%by flow cytometry，respectively

图2 CNE-2及CNE-2R CD133+细胞在无血清培养基中形成的悬浮干细胞细胞球Eig.2 CNE-2 and CNE-2R CD133+cells in serum-free suspension ball forming stem cells culture medium（×100）

表1 各组细胞培养不同时间增殖指数的比较Tab.1 The proliferation index of different cells cultured for different time

2.4 软琼脂克隆形成率检测CNE-2及CNE-2R CD133+干细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验发现，CNE-2R-CD133+细胞克隆形成能力较CNE-2-CD133+细胞明显升高，二者的克隆形成率分别为17.1%和5.9%，而且CNE-2R-CD133+细胞的克隆形态与CNE-2-CD133+细胞相比较明显增大，有显著差异（P＜0.05，图3）。

2.5 裸鼠成瘤实验检测分选的CD133+细胞的成瘤能力CNE-2-CD133-、CNE-2-CD133+、CNE-2RCD133-、CNE-2R-CD133+细胞分别以2×104个细胞各接种4只裸鼠，4周之后，分别有2、4、3、4只裸鼠体内形成移植瘤；两种CD133+细胞在裸鼠体内的成瘤率高于CD133-组，CNE-2R-CD133+高于CNE-2-CD133+组，二者差异明显（P＜0.05，图4）。

图3 分选CNE-2及CNE-2R CD133+细胞的克隆形成能力Eig.3 Clone-forming ability of CD133+cells screened from CNE-2 and CNE-2R cells

图4 免疫磁珠分选CNE-2及CNE-2R细胞中CD133+细胞裸鼠体内成瘤性的比较Eig.4 Comparison of tumorigenicity between CNE-2 and CNE-2R CD133+cells in nude mice

2.6 HE染色和电镜超微结构观察CD133+细胞结构的差异 HE常规染色发现两种移植瘤细胞形态差异不大（图5）。而透视电镜发现CNE-2R-CD133+细胞核大，异型，核仁大，细胞器肥大（图6），说明CNE-2RCD133+移植瘤细胞恶性度高于CNE-2-CD133+。

图5 CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+裸鼠移植瘤细胞的HE染色Eig.5 CNE-2-CD133+and CNE-2R-CD133+xenografts in nude mice by HE staining

3 讨 论

肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSCs）是一种极少数的增殖特性失控、可形成肿瘤、具有干细胞特性的肿瘤细胞［3］，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤增长、复发及转移的根源。TSC具有自我更新、分化潜能、高致瘤性、耐药性及放射抗拒性［4］。

图6 CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+裸鼠移植瘤细胞的电镜观察Eig.6 Electron microscopic examination of CNE-2-CD133+ and CNE-2R-CD133+xenografts in nude mice

目前，已有鼻咽癌肿瘤干细胞系的系列研究，但放射耐受性细胞的相关研究尚未见报道［5］。鼻咽癌干细胞放射抗拒是否直接与放射线损伤修复的能力有关，是否伴随DNA损伤应答提前、修复迅速的机制及相关基因通路参与［6］；此外，肿瘤干细胞的放射抗拒性是否涉及到细胞凋亡、细胞周期、DNA损伤、基因组稳定和DNA修复、血管生成等多个信号转导通路，是否与肿瘤干细胞的自我更新及增殖相关通路的激活等相关，均可通过高通量分子生物信息学技术进行进一步深入研究［7］。

CD133被认为是多种肿瘤干细胞的表面标记物，是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段［8］。本文首次针对一对来源相同，放射敏感性不同的鼻咽癌CNE-2细胞及CNE-2R细胞采用免疫磁珠法分离、筛选鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的CD133+细胞。研究表明，在鼻咽癌细胞株CNE-2及CNE-2R细胞中均可用免疫磁珠分选方法可高效分选出CD133阳性表达的细胞，但二者阳性表达率不同，放射抗拒的CNE-2R细胞具有更高比例的肿瘤干细胞。

我们进一步在无血清成球实验、体外增殖能力，裸鼠体内成瘤试验中发现，CNE-2R-TSC细胞增长幅度均大于CD133-与未分选细胞（P＜0.05）。CNE-2R-TSC CD133+组的细胞增长幅度最大，软琼脂克隆形成能力，裸鼠体内成瘤能力均优于CNE-2-TSC及CNE-2R细胞。

我们认为鼻咽癌细胞中存在一定的肿瘤干细胞，但放射敏感性不同的肿瘤细胞中干细胞比例不同，而且其体外增值能力、成瘤能力及微观形态均有明显的差异，提示鼻咽癌放射敏感性与肿瘤细胞中肿瘤干细胞的存在明显相关，而且放射抗拒的细胞组群中具有更强的自我更新及增殖能力［9］。鼻咽癌细胞中肿瘤干细胞的存在是决定细胞放射敏感性的关键因素［10］。

我们认为从肿瘤干细胞角度研究细胞放射抗拒的机制可以从下面几个方面做进一步研究［11］：①肿瘤干细胞放射敏感性调节相关的信号转导通路；②肿瘤干细胞微环境的改变与肿瘤干细胞放射生物学行为的相关性；③根据肿瘤干细胞放射抗拒生物学机制，探寻逆转关键靶点，以求探索新的调控放射敏感性机制［12］。

我们进一步将在此研究基础上研究不同细胞用不同剂量射线照射后细胞的辐射敏感性，检测其照射后细胞周期及细胞凋亡的改变，DNA放射性损伤的检测以及DNA损伤信号通路相关通路基因及蛋白的检测，探讨鼻咽癌放射抗拒的机制，阐明其分子调控途径和基因表达谱［13］。进一步发掘新的鼻咽癌辐射敏感性的调控靶点，为提高鼻咽癌放疗疗效及放射防护提供理论依据。

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（编辑 韩维栋）

Screening and identification of tumor stem cells in radioresistance human nasopharyngeal carcinoma

WANG Ya-Li，WANG Zhong-Wei，REN Hong-tao，JING Ying-ying，LI Yi
（Department of Oncology，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004，China）

Objective To isolate，screen and identify human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 and radioresistance CNE-2R cancer stem cells.Methods The CNE-2 and CNE-2R CD133+stem cells were sorted with flow cytometry and immunomagnetic beads.The CNE-2-CD133+and CNE-2R-CD133+stem cells were detected for the abilities of tumor sphere formation and proliferation in vitro.The clonogenic ability of CD133+ stem cell was detected by plate clone formation assay and tumorigenicity was detected by nude mice test in vivo. Morphological changes were observed with HE staining and electron microscopy.Results CD133+was expressed（1.79±0.16）%and（2.63±0.72）%in CNE-2 and CNE-2R cells，respectively.The clonogenic ability and tumor sphere formation ability of CNE-2R CD133+cells were much greater than those of CD133-cells.The ability of proliferation of CD133+cell sorted in vitro，especially CNE-2R-CD133+cells，was stronger than that of CD133-cells.The morphological results showed that the nucleus of CNE-2R-CD133+cells was larger and irregular with big nucleolus and organelles.Conclusion Nasopharyngeal CNE-2R-CD133+tumor stem cells isolated and screened can form tumor sphere.The abilities of proliferation and tumorigenesis are stronger.The identification of CNE-2R TSC provides foundation for further studies on the mechanism of radioresistance of nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma；radioresistance；tumor stem cell

R739.63

A

10.7652/jdyxb201505015

2015-01-11

2015-03-30

国家自然科学基金资助项目（No.81141097）Supported by the National Natural Science Eoundation of China（No.81141097）

王亚利.E-mail：yal1wang72@163.com

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.0945.004.html（2015-07-21）