非小细胞肺癌病人源性NOD/SCID 小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立及比较

吴健彬 江 　妹 王 　玥许 　晶岳文涛3* 王子彤*

（1．首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所胸外科，北京 　101149；2．首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所细胞生物学研究室，北京 　101149；3．首都医科大学附属北京妇产医院中心实验室，北京 　100026）

世界肿瘤流行病学统计资料[1]和中国癌症中心公布的数据[2]显示，肺癌高居世界和中国恶性肿瘤发病率与死亡率首位。针对肺癌发病与转移机制，目前虽已研究设计出大量诊断和治疗的相关策略，且在新药开发中取得了显著的进展，但为避免大多数新药由于缺乏临床疗效而遭受巨大经济损失以及影响癌症患者的生活质量[3]，以及在精准医疗个体化用药的背景下，建立优良的动物模型是研究的关键。目前研究者发现病人源性移植瘤(patient-derived tumor xenograft，PDTX)模型是唯一拥有直接来自患者的真正肿瘤靶标的模型[3]，该模型能稳定地保持原代肿瘤中的病理特征、肿瘤微环境和异质性，准确反映肿瘤的特点和干预措施的影响[4-5]，因此是一种合理、真实有效和可行的模型，能为临床个体化治疗等提供研究基础。目前研究显示，PDTX移植瘤皮下模型的F1代成瘤率在20%～60%[6-9]， F2～F5代的成瘤率在75%[4]以上，由此可见，决定皮下移植瘤模型能否成功的关键在于F1代。NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均有报道用于PDTX移植瘤模型中，本研究旨在使用NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠分别建立肺癌的PDTX模型，比较NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠肺癌PDTX模型的成瘤率、成瘤潜伏时间和生长曲线以及病理特征的一致性，探讨两种不同小鼠移植瘤模型的特点，为后续建立更优良的动物模型奠定基础。

1　材料与方法

1.1　实验动物

NOD/SCID小鼠(36只)和BALB/c裸鼠(10只)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[动物许可证号SCXK(京)2016-0011]，均为6～8周龄的雌鼠。NOD/SCID小鼠体质量20～23 g，BALB/c裸鼠体质量15～18 g，所有NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠均饲养于屏障环境下，级别为无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所屏障环境实验动物房[许可证号SYXK(京)2015-0007]。小鼠饲料为清洁级维持鼠料[北京科澳协力饲料有限公司，许可证号SCXK(京)2014-0010]，小鼠饮水由实验动物饮水机提供(北京木牛流马净化工程技术有限公司，MN-LM50J)，小鼠所用垫料及其他与动物接触的物品均经实验动物专用型灭菌器(Siemens smart line)在121 ℃、30 min条件下高压灭菌处理。

1.2　非小细胞肺癌组织标本

非小细胞肺癌组织标本来源于首都医科大学附属北京胸科医院胸外科2016年7月—2016年12月经肺癌手术切除的23例患者，纳入标准：①术前未经过化疗或放疗等相关非小细胞肺癌治疗；②术中冰冻病理结果提示为非小细胞肺癌且最终病理结果为非小细胞肺癌；③能提供足够大小且质地较好的新鲜组织标本。排除标准：①5年内有其他肿瘤病史；②合并活动性肺结核等传染性疾病；③术前已进行肺癌相关治疗。

1.3　肺癌病人源性皮下移植瘤小鼠模型的建立

选取首都医科大学附属北京胸科医院外科手术切除的非小细胞肺癌新鲜无菌组织标本，离体时间≤30 min。组织标本保存在含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素及20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI-1640无菌培养基中，泡沫盒中冰浴，于1 h内接种于NOD/SCID小鼠或BALB/c裸鼠皮下。肿瘤组织在动物房屏障区内进行移植，将肿瘤组织转移到无菌培养皿上，剔除瘤块上的非肿瘤组织和坏死部分，用含20% FBS的RPMI-1640无菌培养基清洗3次，把肿瘤组织剪切成2 mm×2 mm×2 mm的小块，通过套管针经皮接种至小鼠双侧腋下，每例标本接种2只小鼠，共4个部位，接种完成后消毒伤口。将完成接种的小鼠放回小鼠笼具中，在笼外标注小鼠编号、日期等信息。最后将小鼠笼具放回笼架内。整个实验过程均在无菌条件下进行。

1.4　观察和测算

定时观察荷瘤小鼠活动情况、精神状态、皮毛光泽度和移植瘤组织接种部位皮肤改变等情况。扪查移植瘤生长情况，移植瘤移植后双侧皮下包块会先缩小，以包块消失或缩小至小点后，再次以肉眼可见肿瘤或扪及肿瘤，且当移植瘤体的长短径＞3 mm时，记录为肿瘤出现时间。从接种移植瘤组织块开始到肿瘤出现时间，记为成瘤潜伏时间。每例标本移植于至少2只NOD/SCID小鼠或至少2只BALB/c裸鼠皮下，双侧腋下均接种移植瘤，移植瘤出现后开始用游标卡尺测量移植瘤体的长径(rL) 、短径(rw) ，每周2次，肿瘤体积使用如下公式计算：肿瘤体积V=(×r)/2。移植瘤块L在4个月内形成瘤块体积＞1 cm3，提示该移植瘤模型成功，根据测量所得数据，计算移植瘤体积并绘制生长曲线图。若观察4个月后，小鼠瘤块仍未生长，或米粒状消失，则提示该移植瘤建模失败。分别计算NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠的成瘤率，进行比较分析。

1.5　病理学分析

实验结束，处死小鼠，分离移植瘤，肉眼观察移植瘤形态、质地、活动度，观察肺、肝、脾和肾脏以及淋巴结是否存在转移情况，经分离得到移植瘤后，将取出的移植瘤组织以10%中性福尔马林固定液固定，常规石蜡包埋，连续切片后常规HE染色，进行病理学检查分析。

1.6　统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。数据以中位数、均数或百分率表示，采用Fisher精确概率法比较NOD/SCID小鼠组和BALB/c裸鼠组成瘤率差异是否存在统计学意义，采用t检验比较NOD/SCID小鼠组和BALB/c裸鼠组成瘤潜伏时间和成瘤时间的差异是否具有统计学意义，以α=0.05为检验水准。

2　结　果

2.1　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤组织标本相关临床病理指标

外科切除的非小细胞肺癌组织标本共23例，且均符合实验纳入标准。23例组织标本中，18例组织标本移植于NOD/SCID小鼠，其中男13例、女5例；鳞癌8例、腺癌9例、腺鳞癌1例；Ⅰ期9例、Ⅱ期1例、Ⅲ期8例，病例中位数年龄61岁。共5例组织标本移植于BALB/c裸鼠，其中男4例、女1例；鳞癌4例、腺癌1例；Ⅰ期1例、Ⅱ期2例、Ⅲ期2例，病例中位数年龄55岁。对非小细胞肺癌患者临床特征(年龄、性别、吸烟、病理类型、TNM分期及其T分期和淋巴结转移情况)与NOD/SCID小鼠皮下移植模型是否成瘤进行统计学分析，如表1，结果显示：鳞癌、TNM分期和淋巴结转移情况这3个因素与移植瘤成瘤建模成功率无明显相关。

表1　NSCLC患者临床特征与NOD/SCID小鼠移植瘤模型成瘤率的关系

2.2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠生长情况

23例外科切除的组织标本共移植46只小鼠，其中18例移植于36只NOD/SCID小鼠中；5例移植于10只BALB/c裸鼠中。整个实验过程中36只NOD/SCID小鼠和10只BALB/c裸鼠进食、饮水正常，无腹泻、活动迟缓等不良反应。无一荷瘤NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠自然死亡。

2.3　NOD/SCID小鼠模型成瘤情况

18例36只NOD/SCID小鼠共计接种72个部位，其中有10例移植瘤块在4个月内体积达1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，NOD/SCID小鼠移植瘤成瘤率为55.6%(10/18)。NOD/SCID小鼠在接种平均37 d后可再次扪及长短径3～5 mm大小移植瘤，成瘤潜伏时间平均为37 d；在接种后平均79 d移植瘤瘤块体积可达1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功，成瘤时间平均为79 d。生长曲线见图1。

2.4　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大体和形态学观察

图1　NOD/SCID小鼠移植瘤生长曲线

成瘤NOD/SCID小鼠解剖后可见实性结节，呈不规则球体状或蚕豆状，表面被覆肉眼可见鲜红色小血管纹理，切开后可见鱼肉样瘤体，质地较硬，个别瘤体切开内部为乳白色，质地脆。所有NOD/SCID小鼠均未发现肺、脾和肾等主要脏器有转移情况。成功成瘤的10例NOD/SCID小鼠移植瘤中，有6例为鳞癌，3例为腺癌，1例为腺鳞癌，NOD/SCID小鼠移植瘤病理学诊断与临床手术组织标本的病理诊断结果一致，见图2。其中，S004(腺癌)模型(图2)组织学HE染色后，在光镜下可清晰观察到支气管结构，这表明NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保持病人肺癌肿瘤组织的形态特征。

图2　NOD/SCID小鼠模型移植瘤大体和形态学观察

2.5　BALB/c裸鼠模型成瘤情况

5例10只BALB/c裸鼠共计接种20个部位，其中有1例移植瘤块在4个月内体积达1～1.5 cm3，提示移植瘤成功，BALB/c裸鼠移植瘤成瘤率为20%(1/5)。BALB/c裸鼠在接种平均60 d后可肉眼观察到长短径3～5 mm大小移植瘤，接种后平均110 d移植瘤瘤块体积可达1～1.5 cm3，提示移植瘤建模成功。生长曲线见图3。

2.6　BALB/c裸鼠模型移植瘤大体和形态学观察

成瘤BALB/c裸鼠解剖后可见实性结节，呈椭球体状，表面被覆肉眼可见鲜红色小血管纹理，切开后可见鱼肉样瘤体，质地较硬。未发现肺、脾和肾等主要脏器有转移情况。成瘤的BALB/c裸鼠模型病理学诊断为鳞癌，与临床手术组织标本的病理诊断结果一致，表明BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型能保持病人肺癌肿瘤组织的形态特征。

图3　BALB/c裸鼠移植瘤生长曲线

图4　BALB/c裸鼠模型移植瘤大体和形态学观察

2.7　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型成瘤情况的比较分析

从NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潜伏时间和成瘤时间3个因素进行比较分析，如表2所示，NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率(55.6%)，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率为(20%)(P=0.185)；在成瘤潜伏时间上，NOD/SCID小鼠平均为37 d，低于BALB/c裸鼠的平均60 d，差异具有统计学意义(P=0.002)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤潜伏时间较长；在成瘤时间上，NOD/SCID小鼠接种后平均79 d成瘤，低于BALB/c裸鼠在接种后平均110 d的成瘤时间，差异具有统计学意义(P=0.004)，可得出BALB/c裸鼠的成瘤时间较长。

表2　NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤模型成瘤因素分析

3　讨论

2008—2017年10年间NCCN非小细胞肺癌指南[10]更新中可以看出，非小细胞肺癌靶向药物治疗在非小细胞肺癌推荐一线治疗中地位日趋稳固。PDTX模型是唯一拥有直接来自患者的真正肿瘤靶标的模型[3]，能稳定地保留原代肿瘤中的生物学特性[4-5]，2008年Fichtner等[6]将102例肺癌标本移植入NOD/SCID小鼠皮下，并传代移植至裸鼠，成瘤率为25%(25/102)，早期代数移植瘤裸鼠与原临床肿瘤样本组织学、免疫组化和基因突变状态具有高度相似性。2014年Ilie等[11]将100例非小细胞肺癌新鲜组织标本移植入CD1裸鼠或SCID小鼠皮下，成瘤率为35%(35/100)，在组织学和免疫组织化学水平和基因水平均保持了高度一致性，基因水平比较包含高通量测序(next-generation sequencing，NGS)和比较基因组杂交分析(comparative genomic hybridization，CGH)。2017年Wang等[12]将441例肺癌组织标本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率为29% (127/441)，在全基因组测序、单核苷酸多态性、甲基化阵列和磷酸酪氨酸-质谱蛋白质组学分析中具有高度一致性。以上研究均明确指出成瘤小鼠组织能稳定保留相应患者的突变靶点，这为新药的研发和试验提供了可能。

本实验NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率为55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率为20%，与文献报道成瘤率在20%～60%之间[6-9]基本一致，John等[7]将157例肺癌组织标本移植入NOD/SCID小鼠皮下，成瘤率为40%(63/157)。罗朋[8]用21例肺鳞癌组织行裸鼠皮下移植，成瘤率为57%(12/21)。本研究从NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠模型的成瘤率、成瘤潜伏时间和成瘤时间3个因素进行比较分析，如表2所示，可得出NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率55.6%，BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型成瘤率为20%，差异无统计学意义(P=0.185)，这可能与纳入的样本量较小有关。但在成瘤潜伏时间上，NOD/SCID小鼠平均短于BALB/c裸鼠。另外，在成瘤时间上，NOD/SCID小鼠亦短于BALB/c裸鼠。这说明NOD/SCID小鼠比BALB/c裸鼠更适用于非小细胞肺癌皮下移植瘤模型的建立。

成功建模的NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤大体形状和形态学观察如图2和图4所示，NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠移植瘤组织标本与临床手术组织标本的病理诊断结果一致，表明NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型均能保持病人肺癌肿瘤组织的形态特征，特别是图2中的S004(腺癌)模型组织学HE染色后，在光镜下可清晰观察到支气管结构，在皮下模型中见到支气管结构，这更加充分说明了NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型能高度保真病人肺癌肿瘤组织的特性。

在成瘤率、成瘤潜伏时间和成瘤时间3个方面存在较为明显的差异可能是因为NOD/SCID小鼠属于T、B、NK细胞联合免疫缺陷动物，同时还具有循环补体缺乏、巨噬细胞和抗原提呈细胞分化及功能不良的特性，而且渗漏现象少，更容易接受异体移植；而BALB/c裸鼠仅为单一T淋巴细胞功能缺陷，B淋巴细胞功能大致正常，NK细胞活性与鼠龄有关，3～4周龄比同龄普通小鼠活性低，而6～8周龄则比同龄普通小鼠活性高[13]，BALB/c裸鼠体内存在的B细胞和NK细胞发挥了一定的筛选作用，会导致BALB/c裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强，使得成瘤率较低，成瘤潜伏时间和成瘤时间较长，进而影响非小细胞肺癌肿瘤皮下移植瘤模型的建立。

NOD/SCID小鼠和BALB/c裸鼠用于非小细胞肺癌肿瘤皮下移植瘤模型的建立，NOD/SCID小鼠移植瘤模型具有较高的F1代成瘤率(55.6%)，较短的成瘤潜伏时间(37 d)和成瘤时间(79 d)，病理特征均呈基本一致，提示本研究建立的NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型更适合用于病人源性皮下移植瘤模型的建立，这为后续建立更优良的动物模型和采用非小细胞肺癌移植瘤模型进行体外抗肿瘤药物实验的筛选等研究奠定了基础。

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