邻苯二甲酸二辛酯亚慢性暴露对SD大鼠血细胞的影响

任雪丹 李　诺吕中明 * 王民生*

（1．东南大学公共卫生学院，江苏　南京　210009；2．江苏省疾病预防控制中心，江苏　南京 　210009）

邻苯二甲酸二辛酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是邻苯二甲酸酯类(phthalates acid esters，PAEs)的重要成员，也是近代全球使用最为广泛的塑料增塑剂之一，被认为是广泛的环境持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)。DEHP主要用于生产柔性聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料，赋予聚氯乙烯塑料柔韧性，可以占软PVC的40%。由于其实用性和成本效益，DEHP被广泛用于消费产品，包括玩具、个人护理产品、化妆品、农药、涂料、印染、室内装修材料、药品和食品包装材料[1-4]。由于DEHP与塑料基质之间是以不牢固的氢键和范德华力连接，所以伴随使用时间的推移，DEHP不断地从塑料中逸出，挥发至大气、土壤、水域中，造成环境介质、生物、食品等的污染。众多研究表明，DEHP是重要的环境内分泌干扰物，具有雄性、雌性生殖内分泌毒性、肝肾毒性、神经毒性和遗传毒性等多种生物毒性，并带来生物血液和生化方面的改变[5-11]。本研究拟通过对大鼠进行不同剂量的DEHP喂饲染毒，用ADVIA2120i型全自动五分类血细胞分析仪测定各组大鼠血液中白细胞、红细胞和血小板等生理指标的变化，以期研究DEHP亚慢性暴露对大鼠血细胞的影响。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与仪器

DEHP(纯度≥99.5%，美国Sigma公司)、一次性塑料培养皿(美国Corning 公司)、1.5 mL EP管(美国Corning公司)；ADVIA2120i型全自动五分类血细胞分析仪(德国Siemens公司)

1.2　动物饲养与分组

1.2.1动物的分组 健康清洁级SD大鼠100只，雌雄各半，体质量为70～90 g。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京) 2012-0001，质量合格证号11400700158173。在适应性饲养3 d后，将受试大鼠按体质量随机分为5组，即对照组(饲喂基础饲料)、4个DEHP染毒组(染毒剂量分别为5、50、500和2 500 mg/kg)，每组20只，雌雄各半，单笼饲养。

1.2.2动物的饲养 大鼠饲养于屏障环境动物实验室中，实验动物环境使用许可证号SYXK(苏)2012-0037。动物实验室温度控制在20～26 ℃，湿度为40%～70%。各剂量组按相应比例将DEHP均匀拌入饲料中，将饲料以平均每日动物体质量8%的摄食量按组别给予大鼠，连续饲喂染毒90 d。染毒期间，大鼠可自由饮水、摄食。

1.3　指标与方法

1.3.1体质量及食物利用率 观察并记录大鼠在饲养期间的一般情况(如日常行为表现、中毒和死亡情况等)；于每周称量记录体质量、摄食量，并计算总的食物利用率(总食物利用率=总增质量/总摄食质量×100%)。

1.3.2血细胞参数测定方法 90 d喂养结束后，大鼠空腹16 h称量并记录最终空腹体质量，用滴加EDTA抗凝剂的1.5 mL EP管分别取雌雄大鼠全血1.0 mL，应用全自动血细胞分析仪立即进行血细胞分析。检测白细胞总数(WBC)、中性粒细胞(NEUT)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)、单核细胞(MONO)、淋巴细胞(LYM)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、直接测定的血红蛋白浓度(CHCM)、血红蛋白含量分布宽度(HDW)、血小板总数(PLT)、平均血小板体积(MPV)和未染色的大细胞数量(LUC)以及其相应的百分比等指标。

1.5　统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间均数比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，各实验组与对照组用Dunnett’s法比较；组间率的比较采用非参数检验。所有结果用 表示，以α=0.05为检验水准。

2　结果

2.1　DEHP对大鼠体质量的影响

在染毒期间，对照组经观察均未出现异常现象；与对照组比较，DEHP 5、50和500 mg/kg剂量组均未观察到明显的差异；而2 500 mg/kg DEHP染毒组动物则均表现出精神亢奋、被毛蓬松、局部脱毛(头颈部和四肢以及腹部)等中毒体征，摄食量减少，大鼠体质量在染毒后显著下降，差异有统计学意义(p＜0.05)，见表1。

表1　不同剂量DEHP染毒对大鼠体质量的影响(g，-，n=10)

表1　不同剂量DEHP染毒对大鼠体质量的影响(g，-，n=10)

与对照组相比，*p＜0.05.

分组(mg/kg) 雄性 雌性染毒前 染毒后 染毒前 染毒后对照组 78.7±4.1 552.0±23.7 77.7±5.0 312.1±33.9 DEHP 5 78.9±3.6 554.0±39.1 78.5±3.9 327.7±30.7 50 77.9±3.4 544.3±35.2 79.1±5.3 344.7±27.3 500 79.3±2.9 551.2±23.9 79.6±5.3 321.4±39.3 2 500 79.5±4.6 408.1±18.8* 79.9±5.9 273.8±13.6*

2.2　不同染毒剂量DEHP对大鼠食物利用率的影响

在DEHP染毒期间，5、50和500 mg/kg剂量组的体质量和摄食量与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)，而2 500 mg/kg剂量组的大鼠体质量和摄食量与对照组相比明显下降，且差异具有统计学意义(p＜0.05)。见表2。

表2　不同剂量DEHP染毒对大鼠食物利用率的影响(-x±s，n=10)

2.3　DEHP对大鼠白细胞的影响

见表3。结果表明，2 500 mg/kg组雄性大鼠嗜酸性粒细胞(EOS)显著减少，雌性大鼠白细胞总数(WBC)显著降低，与对照组相比差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。在500和2 500 mg/kg剂量下，雌性大鼠淋巴细胞(LYM)与对照组相比显著增加，差异有统计学意义(p＜0.05)。

表3　不同剂量DEHP染毒对大鼠白细胞相关指标的影响(-x±s，n=10)

2.4　DEHP对大鼠红细胞的影响

如表4所示。由表4可见，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg DEHP染毒组红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)与对照组相比显著下降，差异均具有统计学意义(p＜0.01)。

在雌性大鼠中，DEHP 500 mg/kg和2 500 mg/kg组血红蛋白(HGB)显著下降，与对照组相比，差异有统计学意义(p＜0.05)。平均血红蛋白含量(MCH)随着剂量的增加而降低，呈现出剂量-效应关系，在500 mg/kg和2 500 mg/kg剂量下与对照组相比显著下降，差异均有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。在2 500 mg/kg剂量下，平均血红蛋白浓度(MCHC)和直接测定的血红蛋白浓度(CHCM)与对照组相比显著下降，差异均有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。

表4　不同剂量DEHP染毒对大鼠红细胞相关指标的影响(-x±s，n=10)

2.5　不同染毒剂量DEHP对大鼠血小板的影响

见表5。在DEHP染毒期间，未发现其对大鼠血小板各项指标产生影响。

表5　不同剂量DEHP染毒对大鼠血小板相关指标的影响(，n=10)

表5　不同剂量DEHP染毒对大鼠血小板相关指标的影响(，n=10)

平均血小板体积/fL分组(mg/kg)平均血小板体积/fL雄性 雌性血小板总数 血小板总数(×10/μL)3(×10/μL)3对照组 900.6±157.9 7.53±0.78 933.0±121.8 7.23±0.47 DEHP 5 1 008.7±133.5 6.82±0.82 973.8±114.3 6.96±0.45 50 1 042.7±55.1 7.71±0.57 908.6±136.8 6.98±0.48 500 955.6±205.1 7.02±0.41 985.4±94.1 7.13±0.36 2 500 864.0±153.4 8.26±0.91 1 034.2±106.2 7.92±0.60

3　讨论

从DEHP亚慢性染毒对大鼠体质量、增质量、总摄食量及食物利用率的影响结果来看，随着染毒剂量的增加，DEHP 2 500 mg/kg组大鼠的体质量、体质量的增量、总摄食量与对照组相比显著下降，提示，DEHP亚慢性暴露对大鼠的体质量和摄食量有一定的影响。

白细胞是血液细胞的一种，通常也被称为免疫细胞，在机体内更新的速度比较快。作为免疫系统的一部分，具有防御和免疫功能，参与对细菌、病毒等异物入侵时的免疫过程，白细胞各项指标的变化是机体免疫力变化的标志[12]。在DEHP 500 mg/kg剂量下，雌性大鼠淋巴细胞(LYM)与对照组相比显著增加(p＜0.05)，2 500 mg/kg剂量时，淋巴细胞(LYM)持续增加(p＜0.05)，白细胞总数(WBC)显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义(p＜0.05)，说明高剂量的DEHP可能影响机体的免疫系统功能，对免疫细胞产生细胞毒性并破坏白细胞。这也和有关DEHP在高浓度下，可使自由基产生增加，影响机体的抗氧化酶系和引起氧化损伤，从而产生细胞毒性的报道结果相一致[13]。研究[14-16]表明，DEHP具有“佐剂”的作用，能增强免疫原性的活力、诱发哮喘、诱导巨噬细胞分化和分泌促炎性因子，加重炎症过敏反应。

红细胞负责供给全身组织和细胞所需的O2，带走其产生的部分CO2，对机体的正常运行具有重要作用。红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT)主要用来判断有无贫血及贫血的程度，较为常见的是3者降低即为贫血，根据HGB降低程度划分贫血程度[17]。由本研究结果可见，在雄性大鼠中，2 500 mg/kg组红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)和红细胞压积(HCT) 与对照组相比显著下降，差异有统计学意义(p＜0.01)。说明2 500 mg/kg剂量下，DEHP可对大鼠的红细胞产生一定的影响。平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)和直接测定的血红蛋白浓度(CHCM)均为红细胞的平均值，据此可进行贫血的形态学分类[18]。在雌性大鼠中，平均血红蛋白含量(MCH)随着剂量的增加而降低，在500 mg/kg和2 500 mg/kg剂量下与对照组相比显著下降(p＜0.05或p＜0.01)。同时，平均血红蛋白浓度(MCHC)和直接测定的血红蛋白浓度(CHCM) 在2 500 mg/kg剂量下与对照组相比显著降低(p＜0.05或p＜0.01)，说明机体发生了严重贫血，血红蛋白含量显著下降，从而携带O2和CO2的能力也显著降低。

血小板的功能主要是促进止血和加速凝血，以及维护毛细血管壁完整性。在本实验中，不同剂量的DEHP对大鼠血小板的指标无显著影响。说明在本实验中，DEHP对大鼠的凝血止血功能无显著影响。

综上所述，一定剂量的DEHP会对实验性大鼠的体质量、摄食量和血液系统产生影响。

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