miR-135b在鼻咽癌中的表达及其意义

唐金凤，鲁耀邦，胡文铧，王永存，王思捷，杨 腾，吴 平*

（1.广东医学院附属医院临床医学研究中心，广东 湛江 524001；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；3.广东医学院附属医院病理中心，广东 湛江524001；4.广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 524001）

miR-135b在鼻咽癌中的表达及其意义

唐金凤1，鲁耀邦2，胡文铧3，王永存4，王思捷1，杨 腾1，吴 平1*

（1.广东医学院附属医院临床医学研究中心，广东 湛江 524001；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；3.广东医学院附属医院病理中心，广东 湛江524001；4.广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 524001）

目的 探讨miR-135b在鼻咽癌（NPC）中的表达情况及与临床病理特征的关系。方法 收集鼻咽患者活检组织92例，其中NPC组织67例，鼻咽黏膜慢性炎症(CIONM)组织25例。通过qPCR方法检测miR-135b在NPC组织和CIONM组织中的相对差异表达，利用SPSS软件统计分析miR-135b与NPC临床病例特征的相关性。结果 （1）miR-135b在NPC组织中的表达量明显高于CIONM组织(P＜0.01)；（2）miR-135b在不同性别中亦存在明显差异，92例鼻咽患者和67例NPC患者中均存在男性的表达明显高于女性(P＜0.01)；（3）miR-135b的表达与年龄有相关性(r=0.213，P＜0.05)；（4）miR-135b在淋巴结转移中起重要作用，在淋巴结转移患者中miR-135b的表达高于无淋巴结肿大的患者(P＜0.05)。结论 在NPC患者中miR-135b在年龄分组、性别分组及淋巴结是否转移分组中均存在表达差异。miR-135b是NPC的危险因素，为后续探索NPC早期诊断的分子标记物提供理论基础。

鼻咽癌；miR-135b；淋巴结转移；分子标记物

鼻咽癌（nasopharvnx cancer，NPC）是一种与EB病毒感染有关、多基因参与、遗传与环境因素协同作用的恶性肿瘤，在我国两广、福建等地发病率较高，发病率及死亡率都存在性别和年龄的差异[1]。NPC以男性居多，男女发病率比平均为2.5∶1。从年龄上看，NPC的发病率在30岁开始迅速上升，50～59岁呈最高峰，60岁后逐渐稳定[2-3]。目前，NPC的主要诊断方法有：电子鼻腔镜检查、影像学检查和EB病毒血清学检查[4-7]。电子鼻腔镜是目前最主要的检测方法，但是由于NPC早期症状不明显，发病部位较隐蔽，特别是解剖部位在咽隐窝和鼻咽顶部者，鼻腔镜检查较容易漏诊。鼻咽部结构比较复杂，骨、软骨、软组织与淋巴结交错，故影像学检查也较容易误诊和漏诊[4]。EB 病毒血清学检测特异性相对较低，即便能够确诊的NPC也较多已发生淋巴结转移，错过了最佳的治疗时机[8]。因此，寻找一种理想的NPC早期诊断的分子标记物是目前提高 NPC诊断率、降低其死亡率的关键。本试验在前期研究[9]的基础上进一步分析miR-135b与性别、年龄、淋巴转移等临床特征的相关性，为寻找NPC早期诊断分子标记物及发病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集广东医学院附属医院2013年4月至2013年7月NPC和鼻咽黏膜慢性炎症 （chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa，CIONM）活检组织标本，立即放于液氮中保存。所有组织标本活检后均行免疫组化检测经病理学诊断证实，其中NPC组织67例，经病理证实为低分化鳞状细胞癌；CIONM组织25例。男73例，女性18例，年龄17～86岁，所有收集的病例主要来自广东省。本研究遵循伦理学标准并得到本院伦理委员会批准及受试者的知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol（Invitrogen，美国）；+miRNA逆转录试剂盒、miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(KR201，TIANGEN，北京）；miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒 (FP401，TIANGEN，北京)；has-miR-135b（CD201-0213，TIANGEN，北京)；U6(CD201-0145, TIANGEN，北京)；焦炭酸二乙酯DEPC(生工，上海）。

TANKPE060超纯水系统（millipore，美国）；Biophotometer 6131核酸蛋白分析仪 （Invitrogen，美国）；Centrifuge 5418R冷冻高速离心机（eppendorf，德国）；LightCycle 480荧光定量 PCR仪（ROCHE，瑞士）。

1.3 qPCR检测

1.3.1 总RNA提取 常规Trizol试剂抽提组织总RNA核酸蛋白分析仪测定RNA纯度和浓度。

1.3.2 逆转录 按 miRNA逆转录试剂盒 miR-cutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒 (TIANGEN生物公司)说明书进行。

1.3.3 荧光定量PCR 采用荧光定量PCR仪进行定量PCR反应。按miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒（TIANGEN公司）说明书进行，PCR反应条件如下：94℃预变性2 min；94℃变性20 sec、60℃延伸 34 sec，40个循环；60～90 ℃溶 解曲线 分析。miRNA的相对表达量通过公式2-△CT计算，其中U6作为内标。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，每组实验至少重复3次。根据临床资料对年龄、性别、淋巴转移进行分组。miR-135b的荧光定量PCR结果在鼻咽癌与鼻咽黏膜患者分组、性别分组及淋巴结是否转移分组中，方程齐性时采用两独立样本t检验，方差不齐时采用近似t检验；年龄分组中miR-135b的表达结果采用方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。鼻咽癌与miR-135b、性别、年龄的相关性分析采用Spearman双侧检验，miR-135b与年龄的相关性采用Pearson双侧检验，r≥0.8（P＜0.05）为强相关，0.8＞r≥0.4（P＜0.05）为相关。危险因素分析通过二元Logistic回归及ROC曲线分析。

2 结果

2.1 miR-135b在CIONM组织与NPC组织的表达情况

miR-135b在67例NPC组织中的表达量明显高于25例CIONM组织，差异有显著统计学意义（P＜0.01），说明miR-135b在NPC组织中表达上调。见表1。

表1 miR-135b在CIONM组织与NPC组织中的表达情况（±s）

表1 miR-135b在CIONM组织与NPC组织中的表达情况（±s）

注：与CIONM组织比较**P＜0.01。

组织类型CIONM组织NPC组织n 25 67 miR-135b表达0.003 60±0.000 96 0.020 40±0.003 76**

2.2 miR-135b的表达在不同组织类别中与性别的相关性

在92例鼻咽患者中miR-135b在男性患者中的表达明显高于女性患者（P＜0.01)，鼻咽患者男女比例约为3.84；在NPC患者中miR-135b在男性患者中的表达也高于女性患者 （P＜0.05)，NPC患者男女比例为5.7；而在CIONM组织中miR-135b不存在此类情况。见表2。

表2 miR-135b的表达在不同组织类型与性别的相关性（±s）

表2 miR-135b的表达在不同组织类型与性别的相关性（±s）

注：与同组织类别中男性组比较**P＜0.01，*P＜0.05。

组织类型NPC及CIONM组织（n=92）NPC组织（n=67) CIONM组织（n=25) n 性别73 19 57 10 16 9男 女 男 女 男女miR-135b表达0.016 7±0.003 2 0.006 4±0.001 9** 0.020 2±0.004 0 0.007 8±0.002 3* 0.004 4±0.001 4 0.002 2±0.000 4

2.3 NPC与年龄的相关性及miR-135b在NPC患者中的表达与年龄段关系

由统计结果可以看出CIONM患者的平均年龄在36岁左右，而NPC患者的平均年龄在50岁左右，其存在显著性差异（P＜0.01)，结果提示NPC患者的年龄层次偏大。见表3。

在miR-135b的研究中我们以30岁、50岁及60岁为界限来分层，结果显示，miR-135b的表达在30～49岁和50～59岁与小于30岁组别相比存在低表达差异（P＜0.05)，并且NPC患者在4个年龄组别的比例为7∶27∶13∶20。见图1。

表3 NPC与年龄的相关性 （±s）

表3 NPC与年龄的相关性 （±s）

注：与CIONM组织比较**P＜0.01。

组织类型CIONM组织NPC组织n 25 67年龄（岁）36.63±2.41 50.34±1.73**

图1 miR-135b在NPC组织中的表达与年龄段的相关性

2.4 NPC的风险因素分析

NPC与miR-135b、性别、年龄相关，相关系数分别为r=0.485(P＜0.01)、r=-0.232(P＜0.05)、r=0.419 (P＜0.01)；miR-135b与年龄存在相关性，相关系数r=0.213（P＜0.05）。通过ROC曲线分析，年龄和miR-135b均为NPC的危险因素，其95%置信区间分别为0.702～0.891、0.668～0.881。见图2。

2.5 miR-135b与淋巴转移分析

miR-135b在淋巴结转移患者中的表达高于未淋巴结转移患者（P＜0.05），说明 miR-135b在NPC患者的淋巴结转移与否中存在差异。见表4。

图2 NPC风险因素的ROC曲线分析图

表4 miR-135b与淋巴结转移的相关性 （±s）

表4 miR-135b与淋巴结转移的相关性 （±s）

注：与未转移患者比较*P＜0.05。

淋巴结是否转移未转移患者转移患者n 12 55 miR-135b表达0.009 0±0.001 1 0.015 4±0.002 8*

3 讨论

microRNA（miRNA）是在真核生物中发现的一类长约20～25个核苷酸的内源性非编码RNA，具有调控功能并具有高度保守性、时序性和组织特异性。近年研究表明，miRNA参与各类调控途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、脂肪代谢等，还可作为类似癌基因和抑癌基因作用参与细胞增殖、凋亡和分化的调控，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的生物学作用[10-12]。目前已有研究表明miR-135b可影响淋巴瘤、肾癌、胃癌、结肠癌细胞的增殖，调控乳腺癌、肝癌细胞的侵袭和转移[13-15]，另有报道[13]在非小细胞肺癌中miR-135b在高侵染组织中显著高表达，过表达miR-135b能增加肿瘤的发生，而抑制miR-135b的表达能降低肿瘤结节转移，临床还显示肺癌患者中的高表达miR-135b能显著降低总生存率。但miR-135b在NPC中相关的生物学作用研究尚未见报道。

本研究发现NPC中miR-135b的表达明显高于CIONM组织，说明miR-135b在NPC中表现为致癌作用，并可能参与NPC的发生，在NPC诊断方面，NPC发生淋巴结转移为临床诊断中常用的一个治疗方法参考标准。研究发现miR-135b的表达与淋巴结转移有关，淋巴结转移患者中miR-135b的表达高于无淋巴结转移患者，此结果与miR-135b在非小细胞肺癌[13]中的作用相似，其具体作用机制及可否作为NPC诊断的一个分子靶标有待后续研究。NPC与其他癌症相比发病率具有地域、性别、年龄差异等，但其发生的原因尚未有明确定论。在本研究中发现NPC患者中男女比例高达5.7，而miR-135b在男性和女性中的表达也存在差异性，在男性中的表达高于在女性中的表达，我们推测miR-135b可能参与调控NPC发病存在性别差异的过程。统计分析亦表明，年龄越大患NPC的可能性越高。以上结果表明：在NPC患者中miR-135b与其发生，及其性别、年龄、淋巴转移等临床特征具有明显的相关性，且有望将miR-135b作为NPC早期诊断的分子标志物。

综上所述，miR-135b对NPC的发生发展有重要的作用，为miRNA作为肿瘤的早期诊断提供了重要的理论依据。但其影响NPC患者在不同性别、年龄中发病率及淋巴转移的作用机制还有待我们的后续研究。

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（本文编辑 匡静之）

The Expression of miR-135b in Nasopharyngeal Carcinoma and its Significance

Jin-Feng Tang1,Yao-Bang Lu2,Wen-Hua Hu3,Yong-Cun Wang4,Si-Jie Wang1,Teng Yang1,Ping Wu1*
（1.Clinical Research Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical college,Zhanjiang,Guangdong 524001,China;
2.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Pathological Center, Affiliated Hospital of Guangdong Medical college,Zhanjiang,Guangdong 524001,China;4.Cancer Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China）

Objective To investigate the expression ofmiR-135b and clinicopathologicalfeaturesofrelevance in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods 92 cases of nasopharyngeal biopsies were collected,in which were 67 cases of NPC patients and 25 cases of Chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa(CIONM)patients.The expression of miR-135b relative differencesin NPC tissuesand NC tissueswere analyzed by qPCR methods.The correlation ofmiR-135b and nasopharyngeal characteristic was analyzed by using SPSS software.Results (1)The expression of miR-135b in NPC was significantly higher than CIONM (P＜0.01).(2)The expression of miR-135b was significant differences in gender,and 92 cases of nasopharyngeal biopsies and 67 cases of NPC male patients were higher than the female patients(P＜0.01).(3)The expression of miR-135b were correlated with age(r=0.213,P＜0.05).(4)MiR-135b plays an important role in lymph node metastasis,the expression levels of miR-135b in patients with lymph node metastasis was significantly higher than in patients without lymph node enlargement(P＜0.05).Conclusion The miR-135b in the age,gender and lymph node metastasisgroups were differentially expressed in NPC patients.The miR-135b that is a risk factor of NPC nasopharyngeal carcinoma provides a theoretical basis for further exploration of the early diagnosis of NPC molecular markers.

nasopharyngeal carcinoma;miR-135b;lymph node metastasis;molecular markers

R446.8

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.017

2015－04－09

广东医学院科研基金面上培育项目资助（M2014049）。

唐金凤，女，实习研究员，硕士，主要从事肿瘤研究方向。

*吴 平，男，主任技师，硕士研究生导师，E-mail：wping62@126.com。