电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤家兔SOD与线粒体膜电位的影响

沈 菁，王 超*，张佳丽，刘 昭，刘 密，严 洁，常小荣，郭礼娜

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

电针内关穴对心肌缺血再灌注损伤家兔SOD与线粒体膜电位的影响

沈 菁，王 超*，张佳丽，刘 昭，刘 密，严 洁，常小荣，郭礼娜

（湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208）

目的 研究电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）家兔线粒体通透性转换孔（mPTP）开放的影响，及其心肌保护作用机制。方法 新西兰大耳白兔18只随机分为假手术组、模型组、电针组，每组6只。采用冠脉结扎法造模，电针内关组在造模前，给予电针刺激20 min/d，共5 d。采用黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，荧光技术测定心肌细胞线粒体膜电位变化，分光光度法测定520 nm处线粒体吸光度的变化反映线粒体mPTP的开放，原位末端标记法测细胞凋亡。结果 与模型组比较，电针组心肌细胞SOD活力显著提高，凋亡指数降低（P＜0.01），线粒体膜电位显著提高（P＜0.05），线粒体吸光度明显降低（P＜0.01）。结论 电针内关穴可以有效改善心肌缺血再灌注损伤，对心肌产生保护作用。

心肌缺血再灌注损伤；针灸；超氧化物歧化酶；线粒体膜电位；线粒体通透性转换孔

线粒体通透性转运孔(mPTP)开放目前被认为是心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的关键步骤，虽未完全阐明其机制，但大量研究已表明MIRI导致mPTP的开放，引起线粒体功能障碍，最终引起细胞损伤和死亡[1]。针灸作为一种特色的非损伤性中医治疗手段，可以诱导机体产生内源性保护物质，从而达到有效的心肌保护作用，对心血管疾病的防治有着十分重要的意义。本实验主要通过观察电针“内关”穴预处理对兔MIRI线粒体的影响，为电针“内关”穴对心肌的保护作用机制研究提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大耳白兔18只，体质量1.5～2.5 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK湘2011-0012，饲养温度20～25℃，湿度50%～70%。

1.2 主要试剂与设备

细胞线粒体分离试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒 （上海碧云天生物公司），TUNEL细胞凋亡试剂盒（武汉博士德公司）。CRT960荧光分光光度计 （日本日立公司），UV754紫外可见光分光光度计 （上海第三分析仪器厂），ECG-9620P三道自动分析心电图机 （上海光电医用电子仪器有限公司），华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品有限公司），DW2000动物人工呼吸机（上海益联科教设备公司）。

1.3 造模方法[2]

兔耳缘静脉注射20%乌拉坦（4 mL/kg），全身麻醉后仰卧捆绑固定，将心电图机针形导联刺于皮下，红色导联连右上肢，黄色导联连左上肢，绿色导联连左下肢，标准电压：10 mm/mv，走纸速：50 mm/ s，记录心电图。颈部去毛逐层切开皮肤组织，暴露气管，行气管插管，接人工呼吸机辅助呼吸。在胸骨正中线左侧旁开1～2 cm，第三、四肋处逐层切开，暴露心脏，在左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿一根零号医用缝合线，置一硅胶管结扎冠脉，立即监测心电图，以左心室前壁发绀及心电图ST段抬高为缺血标志。阻断冠脉40 min后，松开硅胶管，恢复冠脉灌流60 min。若结扎前心电图异常，则退出实验，在造模过程中家兔死亡则视为造模失败。

1.4 分组及干预方法

18只新西兰大耳白兔随机分为假手术组、模型组、电针组，每组6只。造模成功后，模型组和假手术组：每天捆绑家兔20 min，5 d后，全身麻醉，行开胸手术，暴露心脏后，于左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线静置 40 min，拔线，继续静置60 min，摘取心脏。电针组：电针刺激双侧内关穴，20 min/d，5 d后，其余处理同模型组和假手术组。

1.5 电针方法及穴位定位

电针双侧内关穴，深度约0.5 cm，用平补平泻手法1 min后，接电针，波形为疏密波，刺激强度以兔双上肢轻微颤动为准则，穴位接负极，兔尾部接正极，时间20 min，1次/d，连续7 d。穴位定位参照《实验针灸学》[3]动物常用穴位图谱，并结合解剖位置进行穴位定位，内关：前壁下1/6折点处内侧，桡、尺骨间隙中。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 SOD含量 取家兔颈动脉血6 mL，离心分离血清和血浆，取血清，用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活性。

1.6.2 线粒体的提取纯化 取家兔心尖部组织50～100 mg，按照试剂盒步骤操作提纯线粒体。

1.6.3 线粒体膜电位检测 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液(1X)稀释5倍。5倍稀释的JC-1染色工作液0.9 mL中加入0.1 mL总蛋白量为10～100 μg纯化的线粒体。用荧光分光光度计：检测 JC-1单体时可以把激发光设置为490 nm，发射光设置为530 nm；检测JC-1聚合物时，把激发光设置为 525 nm，发射光设置为590 nm。

1.6.4 线粒体mPTP开放检测 将线粒体置于重悬液中行考马斯亮蓝(BSA)法测定蛋白含量。取线粒体用肿胀液 （120 mmol/L KCl，20 mmol/L MOPS，10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L K2HPO4，pH 7.4）稀释至0.25 g/L的蛋白浓度，于25℃、200 μmol/L的CaCl2作用于线粒体，连续观察在520 nm处线粒体吸光度的变化，该变化反映线粒体肿胀程度，提示mPTP的开放情况。

1.6.5 原位末端标记法测细胞凋亡 取左心室缺血区心肌组织，将其迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醛（0.1 mol/LPBS配置）固定液中固定，每只动物观察2张切片，分别以不加TdT酶者为阴性对照，以脱氧核糖核酸酶（40 μg/mL）消化的切片为阳性对照。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡阳性心肌细胞呈棕黄色。每张切片计数5个高倍视野（×400）中的凋亡阳性细胞核数和总细胞核数，各取其平均值，以凋亡阳性细胞核数与总细胞核数之比计算心肌细胞凋亡指数。

1.7 数据统计方法

2 结果

2.1 电针内关对家兔心电图ST段的影响

模型组、电针组兔心电图 ST段在结扎后40 min均明显升高（P＜0.01），表明造模成功。见表1。

2.2 电针内关对家兔心肌细胞SOD活力及凋亡指数的比较

与假手术组比较，模型组心肌细胞SOD活力显著下降、凋亡指数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，电针组心肌细胞SOD活力显著提高、凋亡指数显著降低（P＜0.01）。见表2。

表1 家兔不同时相ST段比较 （n=6，±s）

表1 家兔不同时相ST段比较 （n=6，±s）

注：与同组结扎前比较△△P＜0.01，△P＜0.05。

组别假手术组模型组电针组结扎前0.021±0.031 0.029±0.018 0.008±0.015结扎40 min 0.025±0.038 0.208±0.145△△0.131±0.085△△再灌注60 min 0.013±0.023 0.199±0.168△0.113±0.035△

表2 电针内关后家兔心肌细胞SOD活力及凋亡指数的比较（n=6，±s）

表2 电针内关后家兔心肌细胞SOD活力及凋亡指数的比较（n=6，±s）

注：与假手术组比较△△P＜0.01，△P＜0.05；与模型组比较※※P＜0.01，※P＜0.05。下表同。

组别假手术组模型组电针组SOD(U/g) 0.358±0.033 0.093±0.019△△0.320±0.025※※凋亡指数（%）0.950±0.487 5.193±0.691△△1.467±0.202※※

2.3 电针内关对家兔线粒体膜电位及线粒体吸光度的影响

与假手术组比较，模型组线粒体膜电位明显下降、线粒体吸光度明显升高（P＜0.01），电针组线粒体膜电位也有下降（P＜0.05）；与模型组比较，电针组线粒体膜电位明显升高（P＜0.05），线粒体吸光度明显降低（P＜0.01）。见表3。

表3 电针内关对家兔线粒体膜电位及线粒体吸光度的影响（n=6，±s）

表3 电针内关对家兔线粒体膜电位及线粒体吸光度的影响（n=6，±s）

组别假手术组模型组电针组线粒体膜电位(red/green) 0.560±0.017 0.226±0.023△△0.515±0.015△※线粒体吸光度0.022±0.006 0.089±0.015△△0.025±0.006※※

3 结论

mPTP是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道,它在心肌细胞的生存、 凋亡中扮演着重要角色。 正常生理情况下,mPTP允许相对分子质量＜1.5×103的离子自由通过,通过氧化磷酸化来驱动ATP合成酶,维持线粒体膜电位及细胞内外的离子平衡。mPTP开放是MIRI的关键步骤。缺血时，心肌细胞线粒体缺乏氧供，组织中ATP含量显著降低，在持续缺血后低pH值(＜6.5)条件下,mPTP会维持关闭状态。再灌注2～3 min后，细胞内的pH值就可以升高到正常[4]，mPTP开放。再灌注最初几分钟造成的损伤比较轻，随后的几个小时内，损伤逐渐加重[5-6]。在应激状态下，mPTP开放会使线粒体内膜通透性增加，引起线粒体基质渗透压增高，导致线粒体基质水肿，外膜破裂，细胞色素C与促凋亡细胞因子等释放，诱导细胞凋亡。此外mPTP开放会破坏细胞内环境，引起线粒体跨膜电位的丧失，耗竭ATP，则会引起细胞坏死[7]。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，是心肌内清除自由基的首要物质,它可对抗与阻断因氧自由基对心肌细胞造成的损害，并及时修复受损心肌细胞。针灸预处理可通过刺激缺血再灌注大鼠使SOD增多而减少其细胞氧化，从而达到心肌保护作用[8]。

本课题组近十年来，一直在研究电针内关穴对大鼠、家兔MIRI的保护作用及其机理，结果证明了[9-12]：电针“内关”穴对MIRI具有保护作用，可促进缺血再灌注动物心电图ST段、T波的恢复，亦能促进缺血再灌注损伤心肌组织形态和超微结构修复，明显抑制缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡。MIRI，会引起心肌舒缩功能降低、心律失常等。其发生机制目前尚未彻底阐明，但认为与自由基的作用、细胞内钙超载和白细胞的激活有关。其中线粒体功能障碍在MIRI中起着重要的作用[13]，其机制包括心肌缺氧使ATP生成减少产生过量的氧自由基导致Ca2+超载和mPTP持续性开放[14]。

本实验结果证实与模型组比较，电针“内关”穴能显著提高SOD清除心肌内过量的有害氧自由基能力，减轻MIRI；同时电针内关还能显著提高线粒体膜电位的稳定性，降低线粒体通透性转换孔的开放，减少心肌细胞的凋亡和坏死，对心肌产生保护作用。

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（本文编辑 匡静之）

Effects of electroacupuncture at Neiguan point on SOD and mitochondrion membrane potential in rabbits with myocardial ischemia-reperfusion injury

Jing Shen,Chao Wang*,Jia-Li Zhang,Zhao Liu,Mi Liu,Jie Yan,Xiao-Rong Chang,Li-Na Guo
(College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the cardioprotective mechanisms of electroacupuncture(EA)at Neiguan point on the opening of mPTP with in rabbits with myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI).Methods 18 New Zealand rabbits were randomly divided into the sham group,model group and EA group,6 rats in each group.The models were established by ligating the coronary artery.The EA group was given electroacupuncture stimulation pretreatment 20 min every day lasting for 5 days before establishing MIRI model.The serum SOD activity was determined by xanthine oxidase method; The mitochondrial membrane potential tested by fluorescent technique;The opening of mPTP in rats with MIRI was evaluated by determining the absorbance of mitochondrion 520 nm using spectrophotometric method;The apoptosis was determined by TUNEL.Results Compared with the model group,the SOD activity of myocardial cell in the EA group was improved obviously,the apoptotic index was decreased(P＜0.01),the mitochondrial membrane potential was improved dramatically (P＜0.05),the absorbance of mitochondrion was reduced significantly(P＜0.01).Conclusion The EA at Neiguan point could improve the MIRI and showed cardioprotective effects.

MIRI;acupuncture;SOD;mitochondrial membrane potential;mPTP

R246；R542.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.016

2015－04－20

国家自然科学基金课题资助(81072868，81102661)；湖南省科技厅课题（2013sk3086）。

沈 菁，女，博士，讲师，研究方向：针灸治病机理的研究。

*王 超，女，副教授，硕士研究生导师，医学硕士，E-mail：592436380@qq.com。