红景天对细颗粒物PM2.5所致急性肺损伤大鼠干预作用的研究

刘平安，莫 阳，张国民*，吴东升，张 彧，张晨阳，彭旭秀（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

红景天对细颗粒物PM2.5所致急性肺损伤大鼠干预作用的研究

刘平安，莫 阳，张国民*，吴东升，张 彧，张晨阳，彭旭秀
（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 研究红景天对大气细颗粒物PM2.5所致急性肺损伤大鼠的干预作用。方法 健康成年Wistar大鼠40只随机分为空白对照组、假手术组、模型组、红景天组。采集空气中细颗粒物制成所需浓度的生理盐水混悬液对模型组和红景天组进行气管滴注，并在染尘前进行灌胃给药。最后一次染毒24 h后，用PBSl灌洗肺部，收集支气管肺泡灌洗液，并检测肺灌洗液中ACP、AKP、LDH、MDA、SOD的含量。结果 （1）PM2.5染尘后肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均升高，模型组与假手术组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；给予红景天煎液灌胃给药后，肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均明显下降；（2）PM2.5染尘后肺灌洗液中的MDA含量明显增加，SOD活性降低；与模型组相比，红景天组的MDA量降低，而SOD活性增加（P＜0.05）。结论 红景天能抑制PM2.5对肺组织所产生的炎症损伤，抑制其对肺组织的损伤与氧化应激效应有关。

红景天；细颗粒物PM2.5；急性肺损伤；氧化应激

细颗粒物（PM2.5）通过损伤呼吸道黏膜上皮细胞，部分沉积在肺泡内或肺间质内，激活肺内的免疫细胞，引起气道炎性反应，造成呼吸系统疾病[1-2]。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，ALI的发病机制复杂，迄今尚无有效的防治药物，各种途径产生的自由基可能是ALI的发病基础[3]。红景天为景天科植物大花红景天Rhadiola crenulata（Hr.f.et Thoms.）H.Ohba的干燥根和根茎，功能益气活血，通脉平喘。《本草纲目》：“红景天，祛邪恶气，补诸不足”。红景天是良好的天然抗氧化剂，可以通过清除超氧阴离子自由基(·O2)、羟基自由基(·OH)、脂氧自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)等，螯合金属离子，抑制脂质过氧化，提高内源性自由基清除系统中关键酶类(超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)等活性，从而降低细胞脂质过氧化程度，减少多余自由基造成的伤害。本实验采用高剂量的PM2.5染毒处理大鼠建立急性肺损伤模型，观察红景天对PM2.5所致急性肺损伤大鼠的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

红景天原药材购自山西千鹤药业有限公司，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科采用JY-13实验用煎药机（吉首市中诚制药机械厂）煎煮红景天粉末90 min，浓缩至生药量0.086 5 g/mL；ACP试剂盒 （批号：20140119），AKP试剂盒 （批号：20140115），LDH试剂盒 （批号：20140117），MDA试剂盒 （批号：20140117))和SOD试剂盒 （批号：20140115)，均为南京建成生物公司；TH-150C型大容量大气总颗粒物智能采样器（北京地质仪器厂）；玻璃纤维滤膜(美国PALL公司)。

1.2 PM2.5的采集及悬浮液的制作

用TH-150C型大容量大气总颗粒物智能采样器采集建筑工地附近空气中的大气颗粒物，并通过20 cm×20 cm的超细玻璃纤维滤膜 （孔径为0.3 μm）筛选出粒径极小的PM2.5颗粒物，连续24 h采样，连续采集1个月，剪短吸附有PM2.5的纤维滤纸对折后侵入超纯水，超声低温震荡30 min，纱布过滤洗脱液后，滤液用4℃、10 000 r／min、20 min离心3次，弃上清液，称质量后 -20℃冰箱保存，用生理盐水配成造模染毒所需浓度37.5 mg/mL的颗粒物悬液，超声震荡15 min后混合均匀，4℃冰箱保存备用[4]。

1.3 动物分组、给药与染毒[5]

正常成年雄性wistar大鼠40只，体质量（200± 20）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK （湘）20140003，SPF实验室适应性喂养1周。随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组、假手术组、模型组、红景天组。空白对照组不作任何处理,假手术组为手术切开气管但不进行PM2.5毒液的染尘造模；另2组大鼠手术切开后气管感染PM2.5毒液进行造模，方法如下：大鼠麻醉暴露口咽部，PM2.5染尘造模（造模剂量为11.25 mg/只）采用气管注入染尘的方法，经气管缓慢注入制备好的PM2.5悬浮液，滴注体积1.5 mL/kg，1次/周，共4次。红景天组术后给予红景天煎液灌胃给药，浓度为0.086 5 g/mL，1 mL/100 g，1次/d（红景天的临床用量为6 g，根据体表面积换算公式换算大鼠等效临床用量为0.173 g），其余3组给予同体积生理盐水1 mL/100 g灌胃，1次/d；各组均给药27 d。手术后的老鼠注射青霉素（100万U/kg）预防术后感染。

1.4 指标检测

1.4.1 肺脏支气管肺泡灌洗液制备 在最后一次染毒24 h后，用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉。在主支气管处剪一小“V”形切口，插入16号的灌胃针头，结扎固定，用 PBS 3.5 mL灌洗肺部，共灌洗 2次，收集支气管肺泡灌洗液 (BALF）至5 mL，1 000 r/min离心15 min，留取上清液置-20℃保存。

1.4.2 肺灌洗液中生化指标的测定 肺灌洗液中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）的测定，严格按试剂盒要求操作。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。对计量资料进行正态性、方差齐性检验。方差齐者用单因素方差分析（F检验）。

2 结果

2.1 各组大鼠肺灌洗液中ACP、AKP、LDH的变化

和空白对照组比较假 手 术 组 的 ACP、AKP、LDH，差异无统计学意义 （P＞0.05）；PM2.5染尘后肺灌洗液中ACP、AKP、LDH均升高，模型组与假手术组比较差异有明显统计学意义 （P＜0.01）；给予红景天煎液后，肺灌洗液中 ACP、AKP、LDH均明显下降，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结果如表1所示。

表1 肺灌洗液中生化指标测定结果 （±s，n=10，U/L）

表1 肺灌洗液中生化指标测定结果 （±s，n=10，U/L）

注：与假手术组相比△△P＜0.01；与模型组相比▲P＜0.05。下表同。

组别空白对照组假手术组模型组红景天组ACP 0.49±0.19 0.50±0.21 1.42±0.32△△0.79±0.29▲AKP 1.74±0.34 1.75±0.51 6.39±1.52△△3.82±0.41▲LDH 872±162 871±123 1 636±87△△1 135±72▲

2.2 各组大鼠肺灌洗液中MDA和SOD量的变化

和空白对照组比较假手术组MDA和SOD差异无统计学意义 （P＞0.05）；PM2.5染尘后肺灌洗液中的MDA含量明显增加 (P＜0.01)，SOD活性降低 (P＜0.01)；与模型组相比，红景天组的MDA量降低，而SOD活性增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结果如表2所示。

表2 肺灌洗液中MDA和SOD活性的比较 （±s，n=10）

表2 肺灌洗液中MDA和SOD活性的比较 （±s，n=10）

组别正常组假手术组模型组红景天组MDA/(nmol/mL) 0.28±0.10 0.29±0.09 2.73±0.49△△1.37±0.29▲SOD/(U/mL) 53.35±6.20. 54.04±5.91 33.07±3.78△△40.58±4.23▲

3 讨论

近年来，大气PM2.5污染受到广泛的关注。研究发现，大气PM2.5浓度每增加10 μg/m3，我国居民每日死亡率上升0.31%，呼吸系统疾病每日死亡率上升1.00%[6]。有研究认为，氧化应激损伤和炎症因子介导是PM2.5毒性作用的可能作用途径[7-8]。急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种直接或间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，主要特征为弥漫性肺间质及肺泡水肿，可导致急性低氧性呼吸功能不全，严重时为急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratorydistress syndrome，ARDs)，至今仍缺乏有效的治疗方法。LDH属胞浆酶，是常用于反映颗粒物细胞毒性的敏感指标。I型上皮细胞损坏及吞噬细胞的破裂均可引起LDH增加，而ACP、AKP、及IL-1β、TNF-α含量的改变常是判断炎症反应的重要参考指标。LDH属胞浆酶，ACP为溶酶体酶，当细胞膜受损或细胞死亡溶解后会大量释出；AKP主要由肺泡Ⅱ型细胞产生，部分由中性粒细胞产生，其活性提示了肺泡Ⅱ型细胞受损程度和中性粒细胞浸润程度[9]。本实验中，大鼠感染PM2.5后，肺灌洗液中ACP、AKP、LDH含量均升高，表明PM2.5对肺组织细胞具有毒效应。红景天组能减少PM2.5对肺的损伤，使ACP、AKP、LDH含量降低。

PM2.5除颗粒物本身具有自由基活性外，还可以作用于上皮细胞和巨噬细胞，使它们释放活性氧或活性氮[10]，这些颗粒物被吸入后，可激发体内的脂质过氧化反应，使体内氧化和抗氧化系统失衡，一方面使得脂质过氧化酶(LPO)增高，另一方面使得体内的抗氧化系统耗竭，表现为谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)下降和LPO/ GSH-PX增高，导致谷胱甘肽转化为氧化型、上皮细胞受到损伤、细胞通透性增加，引起肺损伤和肺疾病，因此测定活性自由基产物、过氧化物酶及抗氧化物如MDA、SOD含量的变化，可以反映 PM2.5对机体的氧化损伤毒性作用[11]。SOD可以抵抗机体内的超氧阴离子损伤，MDA是细胞发生脂质过氧化反应的代表性产物[12]，当机体的抗氧化应激水平增加后，会使体内的氧自由基增多，脂质过氧化物MDA的含量增加，而超氧化物歧化酶SOD是体内阻止氧化自由基重要酶类且能防止脂质过氧化保护机体及组织，脂质过氧化物还能对细胞膜的结构和功能造成不可逆转的损伤，所以体内SOD酶活力和MDA的含量大致能反映机体的氧化应激水平[13]。PM2.5所致急性肺损伤模型为国际通用的模型，具有成功率高、重复性好、稳定性强等优点[5]。本实验显示，染毒后肺灌洗液中SOD下降，MDA升高，表明PM2.5的吸入使体内特别是肺内氧化负荷增加，进一步激发体内的脂、酮氧化反应，肺组织的氧化和抗氧化状态失衡，上皮细胞受到损伤，细胞膜通透增加，引起肺损伤，肺疾病（表现如呼吸功能改变，肺纤维化，慢性气管炎，肺气肿）。红景天可逆转这种氧化应激压力，使SOD升高，MDA下降，因此推测红景天是通过抑制机体的氧化应激改善肺的功能，抑制肺损伤。

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（本文编辑 杨 瑛）

Study of Effects of Rhodiola rosea on Rats of Acute Lung Injury Induced by Fine Particles PM2.5

Ping-An Liu,Yang Mo,Guo-Min Zhang*,Dong-Sheng Wu,Yu Zhang,Chen-Yang Zhang,Xu-Xiu Peng
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To study of Rhodiola rosea on rats of acute lung injury induced by atmospheric fine particles PM 2.5. Methods 40 healthy adult Wistar rats were randomly divided into blank control group, sham operation group,model group,Rhodiola rosea group.The model group and Rhodiola rosea group were treated by intratracheal instillation ofnormalsaline suspension which was made by collecting the fine particulate matterinto the required concentration,and were given by gavage before the dye dust.Last 24 h after infected with PBSl lavage lungs,collecting bronchoalveolar lavage fluid,and detect the contents of ACP,AKP,LDH,MDA,SOD in lung lavage fluid.Results(1)The ACP,AKP,LDH in lung lavage fluid after PM2.5 dye dust were increased,the differences between model group and sham operation group had obvious statistical significance (P＜0.01); The ACP,AKP,LDH in lung lavage fluid were significantly decreased after giving Rhodiola rosea decoction by lavage; (2)After PM2.5 dye dust,the MDA content in lung lavage fluid was increased significantly,SOD activity was decreased;Compared with the model group,the MDA was decreased and SOD activity was increased in Rhodiola rosea group.Conclusion Rhodiola rosea can inhibit the inflammation of lung tissue damage induced by PM2.5,which was related with the oxidative stress effect.

Rhodiola rosea;fine particles PM2.5;acute lung injury;oxidative stress

R285.5

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.002

2015－03－06

湖南省自然科学基金项目（14JJ7062）；2014年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划资助项目（2014-212）。

刘平安，男，副教授，硕士研究生导师，从事中药制剂与教学管理研究。

*张国民，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：834095773@qq.com。