象皮生肌膏对大鼠Ⅲ期压疮新生肉芽组织中TGF-β、FN含量的影响

张月娟，李木清*，王小亮，赵 鸿

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学湘杏学院，湖南 长沙 410007）

象皮生肌膏对大鼠Ⅲ期压疮新生肉芽组织中TGF-β、FN含量的影响

张月娟1，李木清2*，王小亮1，赵 鸿1

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学湘杏学院，湖南 长沙 410007）

目的 研究象皮生肌膏对压疮大鼠新生肉芽组织中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及纤维结合蛋白(fibronectin，FN)含量的影响。方法 180只大鼠中随机取30只大鼠作为空白对照组，对其余150只大鼠进行压疮造模，再随机分为模型组、阳性对照组和实验组，每组30只，模型组予生理盐水纱布外敷，阳性对照组予康惠尔溃疡贴外敷，实验组予象皮生肌膏外敷。治疗后的第7、14、21天每组分别随机选取10只大鼠处死并取相同部位创伤组织制切片，用免疫组化检测TGF-β及FN含量，同时观察三组创面愈合率。结果 实验组愈合所需时间最短、愈合率最高，TGF-β含量在第7天最高且达峰值，FN含量在第14天最高且达峰值；实验组与模型组及阳性对照组在第7天、第14天TGF-β含量、FN含量及创面愈合率间的差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 象皮生肌膏能促进压疮大鼠新生肉芽组织中TGF-β及FN的表达，提高创面愈合率，从而促进伤口愈合。

象皮生肌膏；转化生长因子-β；纤维结合蛋白；压疮模型大鼠；象皮粉；当归

压疮是临床上常见的并发症之一，主要见于长期卧床或瘫痪的病人[1]。由于患者身体局部长期受压，导致局部血液循环障碍而使相应皮下组织缺血缺氧，若不及时诊治，患者可能出现严重感染、甚至全身衰竭而危及生命[2]。象皮生肌膏能有效缩短压疮创面愈合时间[3]，提高临床疗效。本文研究象皮生肌膏对压疮大鼠新生肉芽组织中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及纤维结合蛋白(fibronectin，FN)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD成年健康SPF级大鼠180只，雄性，体质量（260.6±19.3）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK湘2011—0003。分笼喂养，室温保持在24～26℃左右，湿度保持在50%左右，自由饮水及进食，适应性喂养1周。

1.1.2 试剂 鼠转化生长因子-β及纤维结合蛋白ELISA检测试剂盒来自北京杰辉博高生物科技有限公司。

1.1.3 药物 生理盐水，10%水合氯醛 （上海盛利泰化有限公司）；康惠尔溃疡贴[康乐保(中国)有限公司，批号：2640124]；青霉素 （华北制药股份有限公司，批号：F3082108）；象皮生肌膏（湖南中医药大学附一院药剂科自制，湘药制字Z20070276，批号：20120918）。

1.1.4 仪器 圆片形磁片(直径16 mm，厚2 mm)由上海黄浦区东飞机电五金经营部提供，磁片表面的磁通量为1500 GS。DM LB2型双目显微镜 （德国LEICA公司）；MIAS医学图像分析系统 （北航公司）；Shandon325型石蜡切片机 （英国生产）；Motic B5显微摄像系统（麦克奥迪实业集团公司）；JY3002型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 选取SD成年健康SPF级大鼠150只。大鼠模型的建立参照Peirce、Wassermann E等埋置铁片加外用磁铁施压的造模方法[4-5]和葛良鹏等[6]埋置磁片加外用磁铁施压的造模方法。实验当日称质量，造模8 h禁水和禁食，术前肌肉注射8～ 10 IU的青霉素进行预防治疗，然后以10%水合氯醛(300 mg／kg)进行腹腔注射麻醉；对大鼠大腿造模区进行脱毛、消毒、干燥。最后采用亚甲蓝在大鼠右大腿作直径17 mm的圆形标记，用手术刀沿圆形标记做一深至筋膜的切口，钝性分离，将磁片植入大腿部皮下然后缝合，体外采用磁铁间歇性施加压力。通过外源磁片与体内移植磁片相吸，对局部皮肤产生挤压力，造成局部皮肤缺血，持续2 h后，将外源磁片移开；休息30 min后，再将外源性磁片移至内源性磁片之上，持续2 h后，再将外源性磁片移开，如此循环。每只大鼠每日连续3个循环，持续4 d。以大鼠大腿手术区皮肤失去全层皮肤组织，骨、肌腱或肌肉尚未暴露作为判断Ⅲ期压疮的标准[7]。期间每只大鼠单笼饲养，自由饮水与进食，切口喷洒青霉素溶液预防感染。最后成功造模Ⅲ期压疮大鼠136只。

1.2.2 实验动物分组方法 30只大鼠作为空白对照组，造模成功大鼠，选取90只，随机分为模型组、阳性对照组及实验组，每组30只。

1.2.3 治疗方法 4组大鼠分别单笼喂养，换药前均先用无菌生理盐水进行清创，再以1%碘伏消毒，最后以无菌干燥纱布对大鼠局部干燥。模型组予生理盐水纱布外敷，阳性对照组予康惠尔溃疡贴外敷，实验组予象皮生肌膏外敷。4组每天均换药1次。

1.2.4 观测指标及方法 （1）创面TGF-β及FN表达检测 分别于治疗后的第7、14、21天从每组随机选取10只大鼠处死并取相同部位创缘组织，经4%多聚甲醛固定，石蜡切片，采用免疫组化检测TGF-β及FN表达的含量，免疫组化结果测定：阳性染色为棕色颗粒，定位于胞浆和／或胞膜。以APP8.0图像分析软件进行光密度的测量。显微镜下进行组织学观察。（2）肉眼观察创面愈合情况 分别在治疗后的第7、14、21天用数码相机对大鼠创面照相，采用图像分析IPP软件计算未愈合面积、创面愈合率。

创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 4组大鼠创面TGF-β表达结果

实验组在第7、14、21天TGF-β阳性表达都高于模型组（P＜0.01），并高于阳性对照组（P＜0.01）；阳性对照组在第7、14、21天TGF-β阳性表达都高于模型组（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 4组创面TGF-β表达的光密度比较 （±s，n=10）

表1 4组创面TGF-β表达的光密度比较 （±s，n=10）

注：与空白对照组比较△P＜0.05；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照组比较#P＜0.05。下表同。

组别空白对照组模型组阳性对照组实验组第7天90.53±17.92 172.4±17.42△215.6±17.73* 269.3±16.84**#第14天90.01±15.12 148.3±16.42△174.9±16.06* 207.5±16.48**#第21天90.79±20.03 108.3±14.21△138.3±15.08* 172.5±15.57**#

图1 创面中富含TGF-β的纤维细胞分布显微图（免疫组化×400）

2.2 4组大鼠创面FN表达的比较

实验组在第7、14、21天FN阳性表达都高于模型组（P＜0.01），并高于阳性对照组（P＜0.01）；阳性对照组在第7、14、21天TGF-β阳性表达均高于模型组（P＜0.05）。见表2，图2。

表2 4组创面FN表达的光密度比较 （±s，n=10）

表2 4组创面FN表达的光密度比较 （±s，n=10）

组别空白对照组模型组阳性对照组实验组第7天100.7±9.74 178.1±10.52△199.2±10.41* 299.8±12.93**#第14天99.8±10.43 248.3±9.74△304.5±9.81* 490.6±17.63**#第21天100.9±10.11 298.5±13.03△385.5±13.32* 243.5±11.43**#

2.3 创面肉眼观察及愈合率的比较

肉眼观察 （1）实验组：大鼠切割后创面渗出液较多，肉芽迅速生长，呈淡红鲜艳色。肉眼观术后第3天创面开始愈合，第14天基本愈合，第21天完全愈合。（2）阳性对照组：大鼠切割后创面湿润，肉芽生长较缓，色较暗。肉眼观术后第5天开始愈合，第21天仍未全部愈合。（3）模型组：大鼠切割后创面较干燥，色暗。肉眼观术后第7天开始愈合，直到第21天愈合率仍然很低。（4）空白对照组：无变化。所有动物创面均未见明显感染迹象。

图2 创面中富含FN的纤维细胞分布显微图（免疫组化×400）

愈合率的比较 实验组在第7、14、21天愈合率都高于模型组（P＜0.01），且高于阳性对照组（P＜0.05）；阳性对照组在第7、14、21天愈合率都高于模型组TGF-β阳性表（P＜0.05）。见表3。

表3 3组溃疡创面动态愈合率比较 （±s，n=10，%）

表3 3组溃疡创面动态愈合率比较 （±s，n=10，%）

组别模型组阳性对照组实验组第7天32.7±3.2 42.4±4.6* 54.8±4.5**#第14天58.7±4.9 76.5±4.6* 85.6±4.9**#第21天76.8±5.0 92.4±2.9* 100.0**#

3 讨论

压疮，主要是因为局部组织长时间受压，导致相应组织缺血缺氧而使皮下发生病损的一种并发症。而当血液重新恢复后，可能加重机体血管内皮细胞和组织细胞膜再灌注损伤[7]。在传统中医学中，压疮属“褥疮”范畴，认为主要病因是久病卧床，导致气血不和、血运不畅，久之则肌肤失养而导致皮肤溃烂；或者因为长期卧床局部摩擦而导致皮肤破损而发病。治疗上主要以益气、活血、通络、消肿、生肌为主。本实验通过对大鼠Ⅲ期压疮成功造模，然后免疫组化检测转化生长因子（TGF-β）及纤维结合蛋白（FN）的分子生物表达及创面愈合率来评价创面愈合效果，具有实际临床指导意义。

TGF-β是一类具有多功能的细胞因子，是由多组织细胞所合成的，对细胞周期具有调控作用，能够影响细胞的分裂[8]；一般处于无活性的状态，当组织损伤时能激活，TGF-β被释放出来发挥生物学效应[9]。其生物学效应主要通过抑制蛋白酶和基质酶的活性，促进胞外基质沉积，促进前胶原蛋白Ⅰ及纤维素结合素合成，从而增加膜受体、细胞与基质间的相互作用，驱使炎性因子向损伤部位移动，进而诱导新生肉芽组织生成，加速组织的修复[10]。本研究在第一天就检测到了TGF-β，说明TGF-β在细胞开始修复时就发挥了其作用，在第7天达到峰值，这和Rong报道的一致[11]。模型组，阳性对照组，实验组TGF-β含量表达的比较，显示模型组含量在压疮愈合各阶段都表达的最少；阳性对照组含量在压疮愈合各阶段都表达的比模型组多，比实验组少；实验组含量在压疮愈合各阶段都表达的最多。FN主要由血管上皮细胞和纤维母细胞产生，是一种能维持机体的完整性和具有防御功能的物质，广泛存在于体液、细胞表面及结缔组织，主要通过其位点与纤维蛋白原、胶原纤维结合，形成富含FN的基层胶原纤维-纤维蛋白复合物，同时在创缘上皮进行增殖，直至上皮化愈合。FN特别是在皮肤中存在于基膜与相邻细胞间的界面上，在伤口修复愈合中起重要作用[12]。正如本实验研究显示：三组大鼠TGF-β及FN的在创面不同时间段都存在不同程度的表达。实验组压疮创面愈合率显著高于模型组和阳性对照组。说明 TGF-β和FN在压疮创面愈合过程中发挥了重要作用。

本实验研究结果显示：象皮生肌膏组愈合所需时间最短，TGF-β与FN含量分别在第7天、14天最高且达峰值，说明对于压疮损伤大鼠，象皮生肌膏能促进新生肉芽组织中TGF-β及FN的表达，从而促进伤口愈合。

象皮生肌膏组方出自于张山雷《疡科纲要》，是中医外科具有生肌长皮作用的外用药物之一，具有防腐收敛、生肌敛疮、活血止痛、驱痹填髓长肉、抗炎抗感染、清热泻火解毒之功效。实验所用象皮生肌膏为湖南中医药大学附一院药剂科自制药，配方为：象皮粉、当归、生地、生石膏、血余炭、黄蜡、炉甘石、白蜡、龟板、麻油。象皮生肌膏用于压疮的治疗，能有效加速伤口愈合、缩短治疗周期、减轻患者疼痛和不适，本研究为象皮生肌膏进一步的临床推广应用提供了理论基础和实验依据。

[1]黄明海，曾素华，张 伟，等.水胶体敷料治疗压疮的临床研究[J].中国实用医药，2008，3（28）：171-172.

[2]董晓江，吕巧芸.压疮防治新进展[J].护理研究，2010，24（17）：1 516-1 518.

[3]曹文忠，苟耀宁.象皮生肌膏治疗压疮的临床观察[J].中国医药科学，2014，4（2）：74-76.

[4]Peirce SM，Skaiak TC，Rodeheaver GT.Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation：a skin model in the rat [J].Wound Repair Regen，2000，8(1)：68-76.

[5]Wassermann E，Mv Griensven，Gstaltner K，et al.A chronicpressure ulcer model in the nude mouse[J].Wound Repair Regen，2009，17(4)：480-484.

[6]葛良鹏，魏 泓.大鼠糖尿病溃疡动物模型的初步研究[J].中国实验动物学报，2005，13(2)：88-90.

[7]Black J，Baharestani M，Cuddigan J，et al.National Pressure Ulcer Advisory Panel’s Updated Pressure Ulcer Staging System[J]. Dermotol Nurs，2007，19（4）：343-349.

[8]张 勇，秦 娜，于 斌.TGF-β/Smada信号转导通络的研究进展[J].广西医科大学学报，2009，26(1)：155-157.

[9]吴 巍，姚欣欣，朱辛奕.TGF-β在骨组织中作用的研究进展[J].吉林医药学院学报，2009，30(1)：45-47.

[10]王国辉，崔云甫.TGF-β1在胆管损伤修复过程中的作用[J].中国现代普通外科进展，2010，13(5)：376-379.

[11]Rong H，Tang X，Zhao Y，et al.Postsurgical intraperitoneal ex posure toglove powders modulates the inflammatory and immune-related cytokines production[J].J Wound Rep，1997，296 (3)：28.

[12]李学娟，陈泽彬，魏 红，等.大黄素对高糖培养的GMC增殖、FN表达及p38MAPK的影响 [J].中国药理学通报，2014，30(2)：233-238.

（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Xiangpi Shengji Cream on TGF-β and FN in New Granulation Tissue of Rats with Phase III Pressure Ulcers

Yue-Juan Zhang1,Mu-Qing Li2*,Xiao-Liang Wang1,Hong Zhao1
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;
2.Xiangxing College,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To study the effects of Xingpi Shengji cream on TGF-β and FN in new granulation tissue of rats with phase III pressure ulcers.Methods 30 rats from the 180 rats were randomly selected as the blank control group, the other 150 rats were made model of pressure ulcer.The 150 healthy rats were randomly divided into model group, positive control group and experimental group,with 30 rats in each group.The model group was given physiological saline gauze application,the positive control group was treated with comfeel ulcer paste,and the experimental group was treated by external application of elephantiasis myogenic cream.10 rats after treatment of 7 days,14 days and 21 days in each group were randomly selected,and were put to death and take the same parts organization made into slices.The expression of TGF-β and FN was detected by immunohistochemistry and the wound healing rate of three groups at the same time was observed.Results The experimental group was with the shortest healing time and the highest rate of healing.The content of TGF-β and FN,and the wound healing rate at 7 days and 14 days of the experiment group,model group and positive control group were statistically significant(P＜0.05).Conclusion The Xiangpi Shengji cream could promote the expression of TGF-β and FN in new granulation tissue of rats with pressure ulcers.It can improve the wound healing rate to promote wound healing.

Xiangpi Shengji cream;TGF-β;FN;pressure ulcers model rats;Xiangpi powder;Angelica sinensis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.003

2015-04-11

湖南省科技厅计划项目（2012FJ4354）。

张月娟，女，教授，主任护师，博士研究生导师，研究方向：中医护理学。

*李木清，男，主任医师，硕士研究生导师，E-mail：zyjhulibu@163.com。