盐酸青藤碱对雄性大鼠精子质量及睾丸组织的影响

吴红娟，佟 茵，邱赛红，丁雯雯

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

盐酸青藤碱对雄性大鼠精子质量及睾丸组织的影响

吴红娟，佟 茵，邱赛红，丁雯雯

（湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

目的 考察盐酸青藤碱对雄性大鼠精子质量、睾丸组织形态及精子顶体酶、睾丸乳酸脱氢酶活性的影响。方法 SD雄性8周龄大鼠36只，随机分成空白对照组、盐酸青藤碱低剂量组（60 mg/kg）、盐酸青藤碱高剂量组（240 mg/kg），连续给药10周。观察各组大鼠精子密度、活动度、畸形率、活精率、精子顶体酶、睾丸乳酸脱氢酶活性以及睾丸组织形态。结果 与空白对照组比较，盐酸青藤碱使附睾质量系数下降（P＜0.05）；对大鼠精子密度、畸形率、活动度、活精率、精子顶体酶活性无明显影响（P＞0.05）；高、低剂量升高睾丸乳酸脱氢酶活性的作用均有显著性（P＜0.01，P＜0.05）；对睾丸组织形态无明显改变。结论 盐酸青藤碱在等效量3倍、12倍时对精子密度、畸形率、活动度、活精率、精子顶体酶、睾丸组织形态均未见明显不良影响。

盐酸青藤碱；精子质量；精子顶体酶；乳酸脱氢酶；睾丸组织

盐酸青藤碱是从中药青风藤中提取的生物碱，是临床常用的抗风湿药，有抗炎、抑制免疫的作用。基于男性抗精子抗体免疫不育的发病机制与自身免疫有关，拟将盐酸青藤碱用于男性抗精子抗体免疫不育的治疗。前期已完成了盐酸青藤碱对抗精子抗体免疫不育的有效性研究[1]，为进一步考察盐酸青藤碱的安全性，了解在大剂量用药的情况下，对大鼠精子质量、睾丸组织形态及精子顶体酶、睾丸乳酸脱氢酶活性的影响，现将研究内容报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 盐酸青藤碱（编号T-107017），宝鸡永嘉天然植物开发有限公司。

1.1.2 动物 SPF级SD雄性8周龄大鼠36只，体质量160～180 g（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2009-0004；动物合格证号HNASLKJ20102942）。

1.1.3 试剂 精子顶体酶活性试剂盒（底物酶法）：天津瑞爱金生物科技有限公司 （批号111122177）；大鼠乳酸脱氢酶（LDH）活性酶联免疫分析试剂盒：美国RD公司（批号20111106）；甲醛、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、生理盐水等。

1.1.4 主要仪器 GB204电子分析天平（梅特勒托利多公司）；UV-1750紫外可见分光光度计（岛津公司)；高速冷冻离心机（BECKMAN COULTER美国)；RT-6000全自动酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；血球计数板等。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 SD雄性8周龄大鼠36只，适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、青藤碱低剂量组、青藤碱高剂量组，每组12只。据参考文献[2]，本实验采用等效量的3倍量60 mg/kg作为低剂量，12倍量240 mg/kg作为高剂量，灌胃给药。空白对照组给蒸馏水，给药容积均为10 mL/kg。每天上午9时灌胃，1次/d，连续10周。

1.2.2 精子悬液的制备 各组大鼠于末次给药后24 h用颈椎脱臼法处死，迅速取出睾丸、附睾，用脱脂棉粘去脂肪和残血，称质量，将左侧附睾放入4 mL生理盐水中，用眼科剪剪碎，用吸管轻轻吹打5～6次，将其置于 37℃水浴下静置 10 min，用200 μm尼龙筛网过滤后加生理盐水至4 mL，制成精子悬液备用。

1.2.3 精子密度及畸形率检测 据文献[3-4]采用附睾尾精子计数法。取 “1.2.2”法制得的精子悬液2 mL，用血球计数板在显微镜下计数，对计数板的左上、左下、右上、右下角以及正中间的5个中方格进行计数统计；对于压线的精子，采取数上不数下、数左不数右的原则。一个中格精子数的均值乘以16即为0.1 mm3中精子的总数，再除以0.1 mm3即得到精子密度。

取1滴精子悬液于干燥洁净的载玻片上，用4%甲醛溶液固定5 min，均匀推片，于空气中自然干燥，加1%伊红溶液1滴染色15 min，盖上盖玻片，于光学高倍镜（40×）下计数200个完整精子，记录畸形精子数，计算精子畸形率。精子畸形率（%）=畸形精子数/观察精子数×100%。

1.2.4 活精率及精子活动度检测 取1滴精子悬液于载玻片上，再取1滴1%伊红溶液与之混匀，盖上盖玻片。于光学高倍镜（40×）下观察，活精子为无色，死精子为红色，计算活精率。精子活精率（%）=活精子/（活精子+死精子）×100%

取1滴精子悬液于载玻片上，盖上盖玻片，在光学高倍镜下（40×）计数5个视野里的精子数，据文献[5]将精子活动分0-Ⅳ级，并计算活动度。精子活动度(%)=(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)／(0+I+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%。

1.2.5 精子顶体酶活性检测 采用双抗体夹心法测定精子顶体酶活性。取“1.2.2”项制得的精子悬液调节精子浓度后，按试剂盒说明书操作检测精子顶体酶活性[6]。

1.2.6 睾丸乳酸脱氢酶活性检测 按“1.2.2”项取出大鼠左侧睾丸，迅速放入手动玻璃匀浆器中，加冰PBS缓冲液4 mL，于冰浴下匀浆，于4℃下4 000 r/min离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书操作检测睾丸乳酸脱氢酶含量。

1.2.7 大鼠生殖器官脏器系数检测 按 “1.2.2”项处死大鼠后迅速摘取右侧睾丸、附睾、精囊及前列腺，用脱脂棉粘去脂肪和残血，称质量。按脏器质量（g）/大鼠体质量（g）×100%，计算出脏器系数。

1.2.8 雄性大鼠睾丸组织形态检测 将 “1.2.7”项摘取的大鼠睾丸和附睾，称质量并记录后，立刻放入福尔马林溶液中固定保存，送湖南中医药大学组织与胚胎实验室作HE染色，在光镜下观察其形态结构。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析计算。计量资料以“±s”表示，方差齐者采用单因素方差分析，方差不齐者采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 盐酸青藤碱对雄性大鼠精子密度、精子顶体酶活性的影响

对大鼠的精子密度的影响表现为：与空白对照组比较，低剂量的盐酸青藤碱有显著提高精子密度的作用（P＜0.01），而高剂量则使精子密度降低（P＞0.05）；两种剂量的盐酸青藤碱均对精子顶体酶活性无明显影响（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠精子密度、精子顶体酶活性结果 （±s）

表1 各组大鼠精子密度、精子顶体酶活性结果 （±s）

注：与空白对照组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下表同。

组别空白对照组青藤碱低剂量组青藤碱高剂量组n 12 10 11精子密度（×106/mL）40.00±6.65 51.52±8.85▲▲38.11±8.64精子顶体酶（μiu/106精子）53.47±19.12 68.00±21.56 52.71±20.58

2.2 盐酸青藤碱对雄性大鼠精子畸形率的影响

低、高剂量的盐酸青藤碱对大鼠精子的外观形态未见明显不良影响。与空白对照组比较，畸形率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠精子畸形率及睾丸乳酸脱氢酶活性检测结果（±s）

表2 各组大鼠精子畸形率及睾丸乳酸脱氢酶活性检测结果（±s）

组别空白对照组青藤碱低剂量组青藤碱高剂量组n 12 11 11畸形率（%）6.90±0.56 7.02±0.59 7.18±0.74 LDH（IU/L）1.66±0.36 2.01±0.36▲▲1.99±0.37▲

2.3 盐酸青藤碱对精子活动度、活精率的影响

对各组大鼠的精子活动度、精子活精率检测结果显示，盐酸青藤碱低、高剂量组与空白对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠精子活动度、活精率检测结果 （±s，%）

表3 各组大鼠精子活动度、活精率检测结果 （±s，%）

组别空白对照组青藤碱低剂量组青藤碱高剂量组n 12 9 11精子活动度81.42±5.38 85.22±2.29 82.45±8.26活精率74.69±6.46 76.92±8.72 72.47±4.24

2.4 盐酸青藤碱对睾丸乳酸脱氢酶活性的影响

与空白对照组比较，盐酸青藤碱低剂量使睾丸乳酸脱氢酶活性有显著性升高（P＜0.01），高剂量则使睾丸乳酸脱氢酶活性有升高（P＜0.05），见表2。

2.5 盐酸青藤碱对雄性大鼠生殖器官脏器系数的影响

盐酸青藤碱低、高剂量持续给药后可降低大鼠附睾质量，质量系数与空白对照组比较均有显著差异（P＜0.05），但对睾丸、精囊和前列腺质量系数均无明显影响（P＞0.05），见表4。

表4 各组大鼠生殖器官脏器质量系数结果 （±s）

表4 各组大鼠生殖器官脏器质量系数结果 （±s）

组别空白对照组青藤碱低剂量组青藤碱高剂量组n 12 9 11睾丸1.17±0.08 1.14±0.19 1.15±0.08附睾0.41±0.03 0.38±0.02▲0.38±0.02▲精囊0.44±0.06 0.45±0.06 0.43±0.06前列腺0.15±0.03 0.16±0.04 0.14±0.03

2.6 盐酸青藤碱对雄性大鼠睾丸组织形态的影响

空白对照组及盐酸青藤碱低、高剂量组大鼠睾丸组织结构与形态均未见明显异常。各组均表现为曲细精管管壁分层结构完整，层次清晰，腔内有较多成熟精子。精子、精原细胞发育正常，成熟精子较多。间质细胞数目及发育未见异常情况。见图1。

3 讨论

雄性动物的生殖系统包括睾丸、附睾、输精管和精囊等器官。睾丸主要由生精小管和睾丸间质组成，具有产生精子和分泌雄性激素的双重功能，若睾丸组织受到损伤，睾丸曲细精管结构排列紊乱，

图1 大鼠睾丸HE染色显微图

生精细胞、次级精母细胞会有脱落现象，精子畸形率升高等，因此睾丸结构和功能的正常与否直接关系到精子质量[7]。精子顶体酶存在于精子顶体以及赤道部膜上，是受精过程中重要的酶，当精子穿过放射冠到达透明带时，释放顶体酶溶蚀透明带进入卵子内。精子顶体酶直接反映了精子的活力、质量，是判断男性精子质量的重要实验室指标之一[8]。乳酸脱氢酶广泛存在于机体各组织中，在睾丸中主要位于睾丸的曲细精管胞浆内，参与能量代谢并与生精上皮的成熟有关，影响精子的生成、代谢、获能、活动能力和受精过程，其活性可以作为评价精子正常与否，以及受精能力好坏的客观指标[9]。

低剂量盐酸青藤碱能显著提高雄性大鼠的精子密度，对精子活动度、活精率、畸形率、精子顶体酶活性无影响，对睾丸乳酸脱氢酶活性有升高作用。高剂量盐酸青藤碱对雄性大鼠的生殖器官、精子密度、精子活动度、活精率、畸形率、精子顶体酶活性无明显影响，对睾丸乳酸脱氢酶活性有升高作用。盐酸青藤碱低、高剂量组大鼠睾丸组织形态正常，睾丸曲细精管管壁分层良好，精子、精原细胞的发育及数目正常，腔内的成熟精子较多，间质细胞发育良好，未见异常现象。盐酸青藤碱对大鼠附睾质量系数有降低的作用，其机制尚不明确。以上表明，盐酸青藤碱在相当于临床等效量3倍、12倍持续给药10周后，附睾质量系数有所下降，但对精子密度、畸形率、活动度、活精率、精子顶体酶、睾丸组织形态均未见明显不良影响。对睾丸乳酸脱氢酶活性有一定升高作用。

[1]吴红娟，彭江宁，邱赛红，等.盐酸青藤碱对抗精子抗体免疫不育大鼠精子质量的影响[J].中华中医药杂志，2015，30（3）：125-128.

[2]陈 曦，王艳龙.青藤碱研究现状及展望[J].江西中医药，2011，42（338）：69-71.

[3]陈滢如，舒福政，苑鸿雯，等.雌鼠合笼天数与受孕率、排栓数与胎数相关性的实验观察[J].国际中医中药杂志，2011，33（1）：25-27.

[4]凌庆枝，敖宗华，许泓瑜，等.六味地黄汤对雄性大鼠生殖系统的影响[J].中成药，2004，26（7）：561-564.

[5]刘高峰，胡小梅，王春景，等.氯化镧对雄性小鼠精子质量及睾丸酶活力的影响[J].四川动物，2012，31（3）：471-473.

[6]陈 可，包华琼，丁 杰，等.精子顶体酶活性与精液常规检查参数关系分析[J].中国医学创新，2011，8（14）：8-10.

[7]吴培福，曲伟杰，郭爱伟，等.氟致小鼠睾丸组织形态结构损伤的观察[J].畜牧与饲料科学，2012，31（4）：20-21.

[8]于功昌，王筱芬，刘衍忠.苯并咪唑对大鼠生精功能和睾丸酶活力的影响[J].环境与健康杂志，2008，25（8）：711-713.

[9]刘雅峰，欧建平，周灿权.精浆/精子乳酸脱氢酶活性与男性不育的相关性[J].中国优生与遗传杂志，2010，18（2）：121-122.

（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Sinomenine Hydrochloride on Sperm quality and Testicular Tissue Morphology in Male Rats

Hong-Juan Wu,Yin Tong,Sai-Hong Qiu,Wen-Wen Ding
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicne,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the effectofsinomenine hydrochloride on sperm quality and testicular tissue morphology,sperm acrosome enzyme and testis lactate dehydrogenase(LDH)activity.Methods 36 male 8-week-old SD ratswere randomly divided into the blank controlgroup,sinomenine hydrochloride low-dose group (60 mg/kg),sinomenine hydrochloride high-dose group(240 mg/kg),continuous medication for10 weeks.The sperm density,mobility,deformity rate,live sperm rate,sperm acrosome enzyme activity,testis LDH activity and testicular tissue form in each group rats were observed.Results Compared with the blank control group,the body weight index of epididymiswasdecreased (P＜0.05);There were no statisticaldifference in sperm density,sperm malformation rate, sperm motility rate,living sperm rate and sperm acrosome enzyme activity(P＞0.05);The LDH activity of testicular tissue in high and low dose sinomenine groupswere obvioussignificant(P＜0.01,P＜0.05)； There were no differencesin each dose group of hydrochloric acid sinomenine on testicular tissue morphology.Conclusion The three times and twelve times equivalent sinomenine hydrochloride didn't show obvious adverse effect on sperm density,malformation rate,motility rate, living sperm rate,sperm acrosome enzyme and testicular tissue morphology.

sinomenine hydrochloride;sperm quality;sperm acrosome enzyme;lactate dehydrogenase;testicular tissue

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.07.004

2015-04-07

长沙市科技局课题（K09050124-11）。

吴红娟，女，教授，硕士研究生导师，主要从事中药药效与药理的研究。