血小板高反应性对冠状动脉支架内再狭窄的影响

张庆成，张向峰，汪承炜，代祥艳

武警上海总队医院心血管内科，上海 201103

冠状动脉支架置入术后支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)是目前临床最为常见的急性疾病之一，其危险性大，发病机制复杂多样。血小板高反应性(HPR)主要是指通过标准抗血小板治疗后，血小板仍然高度活化并大量聚集而引发血栓。血小板活化与聚集是各种动脉粥样硬化血栓形成及冠状动脉支架内血栓形成的病理生理基础，即使经标准抗血小板治疗，仍有部分冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者发生心血管血栓事件。其中，急性冠状动脉综合征和接受经皮冠状动脉介入治疗的患者发生血栓的风险明显升高。ISR被认为与脂质代谢紊乱、血栓形成和炎症反应等因素有关[1]。

本研究为进一步研究其机制，对2007—2010年在武警上海总队医院心血管内科行冠状动脉支架置入术后452例患者进行随访，经冠状动脉造影或冠状动脉CT检查，选择39例ISR患者入狭窄组，测定a-血小板膜糖蛋白-140(a-GMP-140)、血小板聚集率(PAR)、白细胞分化抗原40配体(CD40L)和基质金属蛋白酶(MMP-s)等指标，旨在探讨HPR在冠状动脉支架置入术后ISR中的致病作用和相互关系，为减少支架置入术后ISR发生率提供依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 患者选择和分组 根据冠状动脉造影或冠状动脉CT检查，选择冠状动脉支架置入术后ISR患者39例为狭窄组，其中男性23例，女性16例;平均年龄66.7岁。狭窄组39例，按照ISR的程度进行分型和分组:Ⅰ型狭窄12例(Ⅰ型狭窄组)，Ⅱ型狭窄11例(Ⅱ型狭窄组)，Ⅲ型狭窄9例(Ⅲ型狭窄组)，Ⅳ型狭窄7例(Ⅳ型狭窄组);根据HPR进行分组:非血小板高反应性(NHPR)组27例，HPR组12例。选择冠状动脉造影或冠状动脉CT检查为血管正常者11例为对照组。对照组患者取血及检查方法与狭窄组相同。

1.2 标本制备 患者分别于就诊当天早晨抽空腹静脉血5～6 ml，注入10 ml肝素抗凝至离心管，摇匀，3 500 r/min离心3 min，取上清，-70℃液化，冷冻待测 a-GMP-140、CD40L、MMP-2、MMP-9 等指标。

1.3 检测指标 (1)CD40L测定:采用酶联法(奥地利Bender Medsystems公司)。(2)MMP-2、MMP-9测定:采用酶联法(北中山公司)。(3)a-GMP-140测定:取静脉血4 ml缓慢注入2% 乙二胺四乙酸二钠的抗凝试管中，混匀，然后取2 ml抗凝血与等量固定试剂混合，固定30 min，采用酶联法测定(苏州医学院)。(4)PAR测定:取静脉血3 ml，按9：1比例与3.8% 枸橼酸钠溶液混合抗凝，以二磷酸腺苷(ADP)10 ml为致聚剂，采用PAM-2型PPP自动平衡血小板聚集仪描记血小板聚集，根据描记计算PAR。

1.4 标准定义

1.4.1 HPR的定义设计 将血小板聚集率＞55%(预实验测定的第75百分位数值)定义为HPR。

1.4.2 冠状动脉支架置入术后ISR分型方法 心血管造影机多部位造影，造影机的图像处理系统作狭窄定性或定量分析。根据所选血管最狭窄处进行评估:Ⅰ型:局灶型，病变长度＜10 mm;Ⅱ型:弥漫性支架内型，病变长度 ＞10 mm，限于支架内;Ⅲ型:弥漫增生型，病变长度＞10 mm，超出支架;Ⅳ型:完全闭塞型。若多个血管段置入支架引起多处狭窄，即以血管最狭窄处为主;管样狭窄同样以最狭窄处为主。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，采用均数±标准差(±s)表示。计量资料釆用t检验;计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义;r＞0.5为存在相关性。

2 结果

2.1 血小板反应性指标与ISR狭窄程度关系 Ⅰ～Ⅳ型狭窄组 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标随冠状动脉狭窄程度的加重而增高，狭窄程度愈严重，a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标增高越明显，以Ⅲ型和Ⅳ型狭窄组最为明显，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 血小板反应性指标与ISR狭窄程度的关系比较(±s)

表1 血小板反应性指标与ISR狭窄程度的关系比较(±s)

注:与对照组比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01。

组别 例数(例)CD40L(ng/ml) MMP-2(ng/L) MMP-9(ng/L) a-GMP-140(μg/L) PAR(%)对照组 11 1.32 ±0.21 94.54 ±34.29 32.55 ±14.01 903.76±301.66 25.52 ±7.07Ⅰ型狭窄组 12 1.51 ±0.80 109.43 ±28.08 40.09 ±50.55a 969.90 ±380.84a 46.98 ±7.21bⅡ型狭窄组 11 1.60 ±0.91a 121.87 ±63.60a 53.57 ±38.79b 1 069.74 ±302.32a 52.02 ±9.03bⅢ型狭窄组 9 2.67 ±1.50b 140.51 ±71.02b 65.66 ±20.73b 1 250.10 ±343.87b 59.88 ±27.90bⅣ型狭窄组 7 2.78 ±1.61b 158.51 ±52.43b 67.79 ±17.60b 1 504.08 ±443.44b 61.90 ±17.97b

2.2 血小板反应性指标与HPR的关系 HPR组a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标较 NHPR 组明显升高，与NHPR组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表2 血小板反应性指标与HPR的关系比较(±s)

表2 血小板反应性指标与HPR的关系比较(±s)

注:与 NHPR 组比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01。

组别 例数(例) CD40L(ng/ml) MMP-2(ng/L) MMP-9(ng/L) a-GMP-140(μg/L) PAR(%)NHPR 组 27 2.06 ±0.41 117.39 ±24.65 45.63 ±20.72 1 191.04 ±39.15 43.51 ±5.59 HPR 组 12 2.62 ±0.94a 136.17 ±30.67a 51.70 ±11.12b 1 405.48 ±410.48b 58.42 ±10.11b

2.3 血清 CD40L、MMP-s与 a-GMP-140水平的相关性 CD40L与MMP-2(r=0.61)、CD40L与MMP-9(r=0.55)、CD40L 与 a-GMP-140(r=0.62)、MMP-2与a-GMP-140(r=0.51)呈相关性(r＞0.5);MMP-9与a-GMP-140无相关性(r＜0.5)。

3 讨论

a-GMP-140是一种血小板膜蛋白，主要存在于血小板a-颗粒膜上，参与细胞连接和血栓形成，为具有特异性的血小板活化分子标志物[1]。HPR与急性冠状动脉综合征和接受经皮冠状动脉介入治疗的患者术后发生不良反应风险增加明显有关。CD40L，即 CD154，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily，IgSF)成员，是一类膜蛋白，它能介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的特异识别与结合，参与细胞内外的信号传导，在血管炎症反应、免疫调节、动脉粥样硬化、血栓和斑块形成等过程中发挥重要作用。MMP-s是一个内源性锌依赖性蛋白酶家族，主要包括MMP-1、MMP-2、MMP-9等，在冠状动脉斑块破裂区域表达增强，通过降解细胞外基质而削弱纤维帽、促进斑块破裂[2]。

本研究发现，Ⅰ～Ⅳ型狭窄组 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标随冠状动脉狭窄程度的加重而增高，HPR 组 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标明显高于NHPR组，表明a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指标更能反映出 HPR的特点且很大程度影响术后ISR的发生发展。在冠状动脉ISR各个阶段的病变过程中，最突出的特点是炎症反应，主要表现为炎症细胞活性增强、血浆中的炎性标志物CD40L等因子增高。其主要机制可能为:(1)CD40L等炎性介质是黏附分子的重要调节因子，Th1细胞表面CD40L与巨噬细胞表面CD40结合，向巨噬细胞提供敏感信号。这些胞外信号与细胞表面的受体结合后能激活细胞内的多条信号传导通路[3]。在这些通路中，激活了的细胞内酪氨酸蛋白激酶和丝/苏氨酸蛋白激酶能使黏附分子细胞内磷酸化，并影响其活化，使活化的黏附分子与配体结合的亲合力增高。黏附分子与其配体结合后又能激活细胞内的其他多条信号传导通路，实现巨噬细胞的进一步激活[4]。巨噬细胞激活后，释放MMP-s。MMP-s通过降解血管壁上粥样硬化斑块纤维细胞外基质，削弱脂质斑块纤维帽，使纤维帽变薄，减低粥样沉积生长率和斑块的稳定性，进而斑块破裂[5]，血小板激活，释放大量 a-GMP-140，促进血栓形成。(2)虽然CD40L主要来自Th1细胞，但在ISR的病变发展过程中，来自血小板表面的CD40L分子的作用同样不容忽视。因为循环中的血小板数目远大于Th1细胞，且血小板具有向受损血管壁黏附聚集的特点。因此，当斑块破裂之后，由活化血小板介导的炎症反应对斑块愈合过程具有非常不利的影响。分析其原因，破损斑块除了外露胶原外，受损的内皮细胞、红细胞、血小板等均可释放出ADP，同时，在此浸润的单核-巨噬细胞又能通过表达组织因子而使凝血酶产生增加，这些高浓度诱导剂的存在，使大量血小板在斑块部位活化[6]，而活化血小板表面的CD40L又反过来与内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞表面的CD40结合，加剧炎症反应，释放MMP-s增加，使斑块更趋不稳定或延迟其愈合，持续的斑块不稳定又会导致更多的血小板发生活化。这种炎症反应与血小板活化相互介导、促进的机制，可能是部分ISR患者病情反复甚至恶化的因素之一[7]。(3)血小板CD40L等炎症介质的激活和巨噬细胞等炎性细胞的浸润可能导致内皮表面的黏附性增加和向内皮下跨膜转移，组织因子浓度增加，增加置入支架血管内栓塞性闭塞和局部血管收缩的危险[8]。所以，CD40L等炎症介质在冠心病的发生发展中发挥重要作用。因此推测，HPR是术后ISR发生的重要影响因素之一，而HPR可能与 CD40L、MMP-s、a-GMP-140等分子引起的链锁反应相关。

[1]戚德清，许康世.GPⅡb基因型急性心肌梗死患者介入治疗前后GMP-140、vWF和 PAI-1水平[J].贵阳医学院学报，2014，39(1):57-60.

[2]张庆成，赵杰，张向峰，等.急性冠脉综合症中40L和基质金属蛋白酶致病作用的研究[J].中华实用诊断与治疗杂志，2011，21(1):66-69.

[3]吴其夏，余应年，卢建，等.病理生理学[M].北京:中国协和医科大学出版社，2003:7.

[4]杨丽霞，田祥全，郭瑞威，等.冠心病患者外周血基质金属蛋白酶诱导因子和尿激酶型纤溶酶原激活物水平与动脉粥样硬化斑块形态特征的关系[J].中华心血管病杂志，2014，42(9):740-743.

[5]Campos TM，Passos ST，Novais FO，et al.Matrix metalloproteinase 9 production by monocytes is enhanced by TNF and participates in the pathology of human cutaneous Leishmaniasis[J].PLoS Negl Trop Dis，2014，8(11):e3282.

[6]Kandasamy AD，Chow AK，Ali MA，et al.Matrix metalloproteinase-2 and myocardial oxidative stress injury beyond the matrix[J].Cardiovase Res，2010，85(3):413-423.

[7]王阿兰，丁效华，黄慧燕.阿托伐他汀对急性冠脉综合征患者血清CD40L和MMP-9水平的影响[J].中国医学创新，2012，9(11):10-12.

[8]Suh SJ，Ko HK，Kim JR，et al.Ethylacetate fraction from Korean on MMP-9 activity and expression and on migration behavior of TNF-a induced human aortic smooth muscle cells[J].Toxicol In Vitro，2011，25(4):767-773.