液相色谱-质谱联用法测定水产品中头孢菌素类残留量

顾蓓乔，梅光明，喻 亮，张小军，朱敬萍，李佩佩

（浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）

浙江省是水产大省，2012年全省约540万t水产品产量，渔业经济总产值约1 600亿。从我省较大规模的渔业生产总量和水产品消费量来看，水产品质量安全在我省显得尤为重要。目前水产品中的一些常见禁用药和限用药使用问题已经得到各级政府部分的有效监管，加上渔民法律意识增强，这些渔药已经很少或不再使用。但是随着生态环境的持续变化和养殖过程出现新的疫情，一些新品种的抗生素开始被推广应用起来，一些原先用在人类或其他动物疾病防治中的抗生素也逐渐被用在水产养殖中。头孢菌素便是一种人畜共用的半广谱抗生素，能够破坏细菌细胞壁，具有高效和低毒优点，自20世纪60年代到现在已经发展到第四代药物。目前较多地被用于畜禽养殖中，但也逐渐用于水产养殖业[1-3]。动物服食药物后，药物在动物的体内累积或蓄存。研究表明长期过量使用头孢菌素会对人体健康带来潜在的危害，而且影响深远，比如产生变态、过敏反应或毒性损伤和泌尿系统损害等[4]，为此包括中国在内的很多国家对头孢菌素在牛肉、猪肉和牛奶等制品中的限量均进行了规定，但都没有包括水产品在内。目前国内针对头孢菌素的检测标准和方法主要有高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法[5-10]，也多集中在畜禽产品上，关于水产品中头孢菌素残留的检测方法较少。为进一步排查水产品中面临的新的安全隐患问题，避免食用头孢菌素超标的水产品，本研究建立适用于水产品中头孢菌素类残留的液相色谱-串联质谱仪测定法，为水产品中头孢菌素药物残留监控工作提供了技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

试验使用的水产品均购于浙江舟山市沈家门东河市场，洗净、去皮、去鳞和去骨后，经高速组织捣碎机均匀捣碎后作为检测用样品。

1.1.2 药品与试剂

实验用水，应符合国家标准一级水的要求；乙腈和甲醇（色谱纯）；乙腈饱和正己烷：取250 mL分液漏斗在其中分别加入正己烷100 mL、乙腈50 mL，然后混合振荡1 min，静置直至分层，取上层；标准物质：头孢氨苄（CAS：16549-56-7）、头孢噻呋（CAS：5575-21-3）、头孢喹肟（CAS：118443-89-3），纯度≥99%；1.0 mg/mL的头孢菌素标准储备溶液：称取适量的3种标准物质，用蒸馏水进行溶解和稀释，储备液贮存在-18℃冰柜中。

1.1.3 仪器设备

ACQUITYTM超高效液相色谱仪、QUATTRO Premier XE三重四极杆质谱仪（配电喷雾离子源，美国waters公司）；IKA T18基本型组织捣碎机（德国IKA公司）；MS2漩涡混合器（德国IKA公司）；Centrifuge 5810高速离心机（Eppendorf公司）；R-201型旋转蒸发仪（上海科兴仪器有限公司）；分析天平，感量0.1 mg和0.01 g。

1.2 试验方法

1.2.1 样品提取

称取5.0 g样品（精确到0.01 g），置于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈涡旋振荡2 min，10 000 r/min下离心10 min，上清液转移至另一50 mL离心管中，残渣中加入15 mL乙腈重复操作1次，合并2次提取液，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡2 min，10 000 r/min下离心10 min，弃掉上层正己烷后把提取液转移至100 mL鸡心瓶中，40℃减压旋转蒸发至干，在鸡心瓶中加入2 mL纯水，使残渣充分溶解，过0.22 μm滤膜后供液相色谱一串联质谱仪测定。

1.2.2 液相色谱参考条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 rnm×50 mm，1.7 μm）；流动相：甲酸水溶液（0.1%）（A）+乙腈（B）；柱温：40℃；进样量：10 μL。流动相梯度洗脱流程见表1。

表1 流动相梯度洗脱流程Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.2.3 三重四级杆质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；毛细管电压：3.50 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；多反应监测（MRM）的扫描模式。反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 反应监测子离子、母离子和碰撞能量的选择Tab.2 Reaction monitoring about ion,parent ion and collision energy,s selection

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与线性范围

用纯水稀释3种头孢菌素混合标准溶液，得到浓度分别为2.00、5.00、10.0、20.0、50.0和100 μg/L系列标准混合工作溶液。三种头孢菌素标准曲线如图1～3所示。结果表明3种头孢菌素在2.00～100.0 μg/L质量浓度范围内均具有呈良好的线性关系，相关系数均大于0.995，其中头孢喹肟标准溶液测定线性方程为y=7.844 51 x+2.416 39（r2=0.997），头孢噻呋标准溶液测定线性方程为 y=135.459 x+72.089 9（r2=0.997），头孢氨苄标准溶液测定线性方程为y=170.261 x+66.594 4（r2=0.998）。

图4为50.0 μg/L的3种头孢菌素混合标准溶液MRM色谱图。由图可以看出，色谱峰形尖锐，信号响应度强，头孢噻呋，头孢氨苄，头孢喹肟出峰时间分别为1.18 min，2.98 min和1.43 min。

图1 头孢氨苄标准工作曲线图Fig.1 Standard curve of Cephalexin

图2 头孢噻呋标准工作曲线图Fig.2 Standard curve of Ceftiofur

图3 头孢喹肟标准工作曲线图Fig.3 Standard curve of Cefquinome

图4 50.0μg/L的3种头孢菌素混合标准溶液MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram of mixed standard solution(50.0 μg/L)

2.2 方法定量检出限

空白草鱼样品通过添加标准溶液后经前处理、上机检测分析，方法定量限（LOQ）为信噪比S/N=10的样品浓度，计算出本方法中头孢噻呋、头孢氨苄和头孢喹肟的LOQs分别为2.0、2.00和10.0 μg/kg，方法回收率均大于80%，由此可见本方法定量限较低，检测灵敏度较高。10.0 μg/kg浓度加标的样品及空白草鱼样品色谱图如图5和图6所示。

图5 空白草鱼试样10.0 μg/kg加标测定MRM色谱图Fig.5 MRM chromatogram of blank grass carp sample spiked with 10.0 μg/kg

图6 空白草鱼试样MRM色谱图Fig.6 MRM chromatogram of blank grass carp sample

2.3 准确度和精密度

在空白大黄鱼和草鱼样品中按高、中、低3个加标浓度下进行标准溶液添加回收测定试验，计算平均回收率和平行测定结果RSD值，考察方法的准确度和精密度。实验结果见表3，从实验结果可知在3个不同加标浓度下，头孢氨苄平均回收率为76.7%～93.1%，头孢喹肟平均回收率为80.5%～93.9%，头孢噻呋平均回收率为78.9%～87.2%，批内相对标准偏差均小于13%，试验结果表明该方法回收率高、精密度好，可满足水产品中头孢菌素类药物残留量的检测要求。

表3 空白试样不同加标浓度下的回收率和精密度（n=6）Tab.3 Results of recovery and precision of spiked samples(n=6)

3 结论

研究确立了水产品中头孢菌素残留量的超高效液相色谱-质谱联用法测定的样品前处理和分析测试条件，建立了合适的样品前处理方法及色谱分离和质谱测定条件。该方法简便快速，基体干扰小，线性范围宽，回收率和检出限满足分析检测要求，可以适用于水产品中该类药物残留监控。

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