食用菌壳聚糖卡波姆复合凝胶的稳定性及其抑菌效果

庄远红， 刘静娜， 黄家福， 林娇芬， 潘裕添*

(1.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建 漳州 363000；2.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000)

庄远红1,2， 刘静娜1， 黄家福1， 林娇芬1,2， 潘裕添1*

(1.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建 漳州 363000；2.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000)

以食用菌壳聚糖为原料，卡波姆为凝胶增稠剂，三乙醇胺为中和剂制备含1%壳聚糖的壳聚糖-卡波姆复合凝胶，通过研究pH对该复合凝胶稳定性、色度、水分活度、质构特征及抑菌效果的影响，确定复合凝胶的最优pH值。结果表明：壳聚糖凝胶与卡波姆具有较好的相容性，复合凝胶的质地均匀细腻，无异味，性质温和，稳定性好；pH对复合凝胶的外观特性、水分活度、质构特性影响较小，但pH值越大，贮藏期内霉变越小；pH 7.0～7.5的复合凝胶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)和白色假丝酵母菌(Candidaalbicans)的抑菌效果特别明显，抑菌率分别为92%、94%和96%。

壳聚糖； 卡波姆； 复合凝胶； 稳定性； 质构； 抑菌活性

Summary Chitosan, a cation polysaccharide, is a product of chitin by partial deacetylation. It can be dissolved in some acid solvents to be polyelectrolyte hydrogel. However, the hydrogel has low mechanical strength and stability, and is difficult to smear. Carbomer is a kind of cross-linked polyacrylic acid resin containing a large number of free carboxyl. The gel made of carbomer can form transparent film on the skin and has strong adhesiveness. Therefore, it has been widely used in novel pharmaceutic adjuvant, gel and cream production.

In this study, a chitosan-carbomer complex gel was prepared using edible chitosan as a raw material, carbomer as a thickener, trolamine as a neutralizing agent, and the content of chitosan was 1%. The pH of the complex gel was also optimized for the best stability, chromaticity, water activity, texture and antibacterial activity. And its antibacterial effect was also studied.

The results showed that the prepared chitosan-carbomer complex gel was yellowish, semi-solid and apt to smear. The appearance, elasticity, hardness, adhesiveness, gumminess of the gel was independent of pH. However, it was more stable in storage under the higher pH value. The chromaticity decreased with the rise of pH, illustrating that the complex gel and chitosan gel exhibited similar color in the pH range of 7.0 - 7.5. The complex gel was stable in texture and its properties had no significant change as the storage time extended. The antibacterial effect of the gel onStaphylococcusaureus,Escherichiacoli,Candidaalbicanswas outstanding in the pH range of 7.0 - 7.5, with the antibacterial activity of 92%, 94% and 96%, respectively. When applied to the thigh and inner side of the arm, the complex gel exhibited high compatibility with skin, and was easy-to-spread, and no peculiar odour and allergic phenomenon such as redness, itching, blisters, and small skin irritation were observed.

The above results show that the prepared complex gel has a fine consistency with skin, and it can also inhibit the growth ofE.coli,S.aureus, andC.albicansin the pH range of 7.0 - 7.5, suggesting that the product can be used in daily chemical products. In a word, this study improves the value of chitosan extracted from edible mushrooms, widens its applying range and provides the theory gist for its application.

壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素部分脱乙酰基产物，是一种安全无毒的天然高分子阳离子多聚糖，具有生物相容性、成膜性、生物黏附性、抗菌性等特点[1]，它是目前发现的唯一天然碱性多糖。壳聚糖作为一种亲水性天然高分子，仅溶解在某些酸性溶剂中，能够制成聚电解质水凝胶，吸附一些带负电荷的物质而具有抑菌效果，但形成的凝胶具有机械强度低、不易涂展、稳定性差等缺点。若将壳聚糖与其他基质复配，制成复合聚电解质水凝胶，则具有良好的生物兼容性和可生物降解性[1]。近年来，国内外以壳聚糖为主要基质制备凝胶取得了一些进展[2-7]，但这些研究中运用化学交联技术制备的壳聚糖凝胶，因交联剂大部分为毒性较高的醛类，运用上存在一定的安全隐患，并且会改变壳聚糖的基团特性，而物理交联所形成的凝胶稳定性、生物亲和性、抑菌性等也受pH、温度、离子等影响，并且在制备过程中容易发生絮凝沉淀等不良反应。卡波姆(carbomer)为丙烯酸键合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，是一种全合成聚丙烯酸化合物，含有大量游离羧基(56%～68%)，具有较强的吸湿性；质量分数为1%的卡波姆水分散体在pH为2.5～3.0，利用氢氧化钠和三乙醇胺作为中和剂可使其卷曲的分子因电斥力张开或形成氢键而增稠形成凝胶[8]。以卡波姆为辅料制备的凝胶剂质地均匀，涂布在皮肤及黏膜上可形成透明的薄膜，附着性强，无油腻感，与皮肤黏膜的耦合效果好，且释药快，作用迅速[9]，已作为新型的药用辅料，广泛用于凝胶剂和乳膏剂的研究生产中，2005年已收载在《中国药典》中。祁智等[10]采用壳聚糖和卡波姆2种新型药用辅料为基质的凝胶剂研制双氯芬酸钾壳聚糖凝胶剂，发现二者配合使用所制备的外用凝胶剂成型性较好。目前市面上的壳聚糖主要以虾、蟹壳为原料制备，其钙离子、蛋白质含量高，脱乙酰度低且不稳定[11]，使用上也会对部分虾、蟹过敏人群产生不良反应，而食用菌壳聚糖是从真菌菌丝和子实体中提取的，脱乙酰度高且稳定，灰分含量少，产品性能优良，无不良反应。本研究以食用菌壳聚糖为原料，以卡波姆为辅料，利用壳聚糖的阳离子和卡波姆凝胶的聚阴离子电解质的性质研制一种新型的聚电解质复合凝胶，制备不同酸碱条件下2个大分子间的复合模型，利用二者的协同增效作用改善壳聚糖凝胶机械强度大、涂展性不良、稳定性差等不足，制备成本较低、均匀稳定、易于涂抹吸收的凝胶，筛选在合适pH下发挥最大抑菌功效的壳聚糖-卡波姆复合凝胶应用于日化用品上，实现天然产物食用菌壳聚糖高值产业化，为食用菌壳聚糖在日化用品中的应用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

食用菌壳聚糖(福建科人生物科技有限公司)，卡波姆940(青岛天力源生物科技有限公司)，三乙醇胺(西陇化工股份有限公司)，大肠埃希菌(广东省微生物菌种保藏中心)，金黄色葡萄球菌(广东省微生物菌种保藏中心)，白色假丝酵母菌(广东省微生物菌种保藏中心)，普通肉汤培养基和营养琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)。

1.2 实验仪器

AR124CN电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)，JC101型电热鼓风干燥箱(上海成顺仪器仪表有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南省巩义市予华仪器有限公司)，EL20K实验室pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)，JHBE-50S闪式提取器(西安太康生物科技有限公司)，TA-Plus质构仪(英国LLOYD公司)，Color FlexTM色度仪(美国Hunter Lab公司)，80-2电动离心机(江苏省金坛市科析仪器有限公司)，立式压力蒸汽灭菌器和SPX-250B-Z型生化培养箱(上海博迅实业有限公司)，SW-CJ系列净化工作台(江苏省苏州市安泰空气技术有限公司)，RW20顶置式电子搅拌器(德国IKA集团)。

壳聚糖凝胶的制备：取3 g食用菌壳聚糖溶于体积分数为1%的乙酸中，破碎使其充分溶解，用三乙醇胺调至碱性，抽滤，水洗至中性，再抽滤，加入适量的超纯水，反调至酸性，得到黏稠态胶状物，控制壳聚糖质量分数为3%，破碎后得到光滑细腻的壳聚糖凝胶。

卡波姆溶胶的制备：取适量超纯水，撒入卡波姆，自然溶胀24 h，制得质量分数为1%的卡波姆溶胶。

复合凝胶的制备：称取33 g质量分数为3%的食用菌壳聚糖凝胶，加入67 g卡波姆溶胶，滴加三乙醇胺调节pH分别为5.5～6.0，6.0～6.5，6.5～7.0，7.0～7.5，破碎后制得食用菌壳聚糖质量分数为1%的复合凝胶。每个处理重复3次。

1.4 测定方法

1.4.1 外观特性 观察复合凝胶的色泽、气味、稠度、均匀度、光泽度和涂展性能。

1.4.2 凝胶稳定性 离心法：取样品5 g于离心管中，以2 500 r/min离心30 min后，观察是否有水分析出及分层现象[12-13]。

耐热耐寒性：样品置于85 ℃水浴中6 h，取出，在室温下观察外观是否变化，凝胶有无分层现象；再将样品置于-18 ℃冰箱内24 h，取出解冻后，观察外观是否变化，凝胶有无分层现象。

留样观察：取3批样品置于透明玻璃瓶中，置室温避光贮存6个月，对其感官性状、pH及霉变情况进行观察测定，每5 d测定1次。

1.4.3 皮肤刺激性 选取10位志愿者，将样品涂抹于大腿和胳膊内侧，观察涂抹部位是否有过敏现象。

1.4.4 凝胶色度 使用Color FlexTM测色仪，以质量分数为3%的食用菌壳聚糖凝胶为标样测定色差值ΔE*，其值大小表示复合凝胶样品与标样的颜色差别程度。

1.4.5 凝胶质构 使用TA-Plus质构仪，采用TPA模式，选用直径12.7 mm柱形探头。具体参数设定：测前速度1 mm/s；测试速度1 mm/s；测试后速度1 mm/s；测试距离30.0 mm。测定项目：硬度、弹性、黏聚性、胶着性。每5 d测定1次，观察1个月内凝胶的质构变化。

1.4.6 凝胶水分活度 采用康威氏扩散法[14]测定。

1.4.7 凝胶的抑菌性能 采用琼脂扩散纸片法和菌落计数法测定复合凝胶对待测菌种(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色假丝酵母菌)的抑菌效果：制备含有1×108个/mL待测菌种的菌悬液，均匀涂布于凝固的营养琼脂培养基平板表面，每个平板100 μL。在无菌条件下将复合凝胶均匀涂于直径为0.3 cm、灭菌烘干过的滤纸片上，将制备好的复合凝胶纸片(以灭菌滤纸片作为空白对照组)贴于涂布好测试菌种的平板上，每个平板上的纸片重复数为4，37 ℃恒温培养24 h；取接触面培养物作梯度稀释，取1 mL稀释菌悬液于平板上，用琼脂倾注平板，混匀，待凝固后倒置于37 ℃恒温箱中培养24 h，参照GB 47892—2010[15]计算菌落总数。

抑菌率/%=(空白对照菌落总数-凝胶菌落总数)/空白对照菌落总数×100。

2 结果与分析

2.1 复合凝胶的感官评定

由表1可以看出，随着pH的升高，复合凝胶色泽稍有加深，在pH 5.5～6.0时呈透明淡黄色，pH 7.0～7.5时呈淡黄褐色，其余形态基本不变，均为半固体凝胶，有光泽感，质地细腻均匀，稠度适宜，无异味，易于涂抹，有清凉感。

2.2 复合凝胶的稳定性

从表2可以看出：复合凝胶性状稳定，不受pH影响；但pH会影响复合凝胶的耐储性，pH越低，越容易长霉，pH 7.0～7.5的复合凝胶贮藏稳定性最好。后期制作可杀菌后灌装，提高其贮藏稳定性。

2.3 复合凝胶的皮肤刺激性

将复合凝胶涂抹在10位志愿者的大腿和胳膊内侧。结果表明：制备的复合凝胶均易涂展，无发生红肿、瘙痒、起水泡等过敏现象，对皮肤刺激小，产品性质较温和。

表1 复合凝胶的外观特性

Table 1 Appearance characteristics of the complex gel

pH外观特性Appearancecharacteristics色泽Colorandluster形态Modality气味Odour触觉Touchsensation5.5～6.0淡黄色,透明,有光泽Lightyellow,hyaline,luster6.0～6.5淡黄色,有光泽Lightyellow,luster6.5～7.0淡黄褐色,有光泽Aloma,luster7.0～7.5淡黄褐色,有光泽Aloma,luster半固体凝胶,质地细腻均匀,稠度适宜Semi-solidgel,smoothanduni-form,suitableconsistency无异味Nopeculiarsmell易于涂抹,有清凉感Apttosmear,coolfeeling

表2 复合凝胶的稳定性

2.4 pH对复合凝胶色度的影响

由图1可知，以质量分数为3%的壳聚糖凝胶为标样，壳聚糖-卡波姆复合凝胶的色差值随pH的增大而减小。说明pH越高，复合凝胶与壳聚糖凝胶的色泽越接近，呈黄褐色，这与感官评定结果相符。

图1 pH对复合凝胶色度的影响

2.5 pH对复合凝胶质构的影响

由图2可知，pH对复合凝胶质构的影响不大，变化幅度均较小，其弹性、硬度、黏聚性和胶着性分别在0.90～0.99 mm、0.28～0.42 N、0.23～0.29和0.05～0.13 N之间波动。

图2 pH对复合凝胶质构的影响

2.6 贮藏时间对复合凝胶质构的影响

由图3～6可知，随着贮藏时间的延长，复合凝胶的黏聚性、胶着性、硬度和弹性变化均不是很大。说明复合凝胶的质构稳定。

图3 贮藏时间对不同pH复合凝胶黏聚性的影响

图4 贮藏时间对不同pH复合凝胶胶着性的影响

图5 贮藏时间对不同pH复合凝胶硬度的影响

2.7 pH对复合凝胶水分活度的影响

水分活度是衡量水分与物质成分的结合程度或游离程度，它可定义为物质中水分活性或自由水含量，影响物质的物理、化学、机械、微生物特性，包括流淌性、凝聚、内聚力和静态现象[13]。微生物的生长特性直接受水活性值影响，凝胶水分活度的大小可以反映凝胶的贮藏稳定性。由图7可知：在pH 5.5～7.0范围内，水分活度随着pH的增加而缓慢增加，变化不大且具有较高的水分活度；在pH 7.0～7.5范围内水分活度值最低，原因可能是在中碱性环境下，壳聚糖分子间和分子内的氢键作用被破坏以及卡波姆的羧基解离程度加大，整个凝胶体系中的基团相互作用，分子链相互缠绕致使亲水性能降低，水分子与凝胶基质的结合程度升高，自由水含量减少，水分活度降低。这也间接验证了pH 7.0～7.5复合凝胶不易长菌，耐储性能最佳。虽然pH 7.0以上复合凝胶的水分活度降低，但数值变化很小，故pH对复合凝胶的水分活度影响不大。

图6 贮藏时间对不同pH复合凝胶弹性的影响

图7 pH对复合凝胶水分活度的影响

2.8 pH对复合凝胶抑菌效果的影响

由图8可知，复合凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色假丝酵母菌均具有较强的抑菌效果，最高抑菌率均达到90%以上。其中pH 7.0～7.5的复合凝胶对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色假丝酵母菌的抑菌率分别为92%、94%和96%，抑菌效果特别明显。

图8 pH对复合凝胶抑菌效果的影响

3 结论

本实验制备的壳聚糖-卡波姆复合凝胶为淡黄色半固体凝胶，无刺激性气味，稠度适宜，与皮肤相容性好，易于涂抹，有清凉感，温和无刺激。pH对复合凝胶的感官质量、质构特性、水分活度影响较小，但pH越大，贮藏期内霉变越小，pH 7.0～7.5的复合凝胶6个月后仍不长霉，贮藏稳定性最好。复合凝胶对供试菌株均具有较强的抑菌效果，其中pH 7.0～7.5的复合凝胶品质好，耐贮藏，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色假丝酵母菌的抑菌效果特别明显，抑菌率分别为92%、94%和96%，推测复合凝胶将对由于这些菌引起的妇科阴道疾病、伤口感染、皮肤癣病等具有较好的抑制作用.

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Zhuang Yuanhong1,2, Liu Jingna1, Huang Jiafu1, Lin Jiaofen1,2, Pan Yutian1*

(1.EngineeringTechnologicalCenterofMushroomIndustry,MinnanNormalUniversity,Zhangzhou363000,Fujian,China; 2.CollegeofBiologyScienceandTechnology,MinnanNormalUniversity,Zhangzhou363000,Fujian,China)

chitosan; carbomer; complex gel; stability; texture; antibacterial activity

福建省漳州市自然科学基金(ZZ2013J06)；福建省教育厅A类科技项目(JA12213；JA14205).

联系方式：庄远红，E-mail:yuanhongzhuang@qq.com

2014-09-04；接受日期(Accepted)：2014-12-17；网络出版日期(Published online)：2015-03-20

TQ 464; R 943

A

*通信作者(Corresponding author)：潘裕添，E-mail:xmpyt@sina.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20150320.2016.010.html