产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度研究*

夏 天 ，崔 迎 ，任文鑫 ，杨晓莉 ，毋堃杰 ，李宏铎 △

（1. 陕西省西安市食品药品检验所·国家药品监督管理局重点实验室，陕西 西安 710054； 2. 陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065）

水分活度由澳大利亚科学家Scott 于1953 年提出，是指产品水蒸气压与同温度下纯水蒸气压的比值［1-2］。其在本质上可理解为结合水含量越高，水分活度越低［2］，可用于微生物生长繁殖的水越少［3-4］。作为微生物可利用水量度的重要参数，水分活度也是影响微生物生长的关键因素［5］，在食品和化妆品的微生物控制方面已有应用［6-7］。2006 年，《美国药典》1112 章节中已发布水分活度测定在非无菌制剂中的应用指导原则［8］。本研究中参考该指导原则中产气荚膜梭菌生长所需的最低水分活度（0.95）及文献［9 - 12］，分别以氯化钠、葡萄糖和甘油作为水分活度调节剂，调节培养基的水分活度值在 0.90～0.99 范围内［2，13］，测定产气荚膜梭菌生长所需的最低水分活度，以为《中国药典》相关内容的增订提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与菌种

仪器：Aqualab 4TE 型水分活度仪（美国Meter Group Inc.）；THERMO1378 型生物安全柜（赛默飞世尔科技有限公司）；LRH-250 型生化培养箱（上海一恒科技有限公司）；SX - 500 型高压蒸汽灭菌器（日本Tomy公司）；SQP 型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度为10 mg）。

试剂：硫乙醇酸盐流体培养基（FTM，北京三药科技开发公司，批号为170808）；胰胨- 亚硫酸盐- 环丝氨酸琼脂培养基（TSC，北京路桥技术有限责任公司，批号为171108；氯化钠（批号为20180509），丙三醇（批号为20180223），均购自国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20180110）。

菌种：产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，广东环凯生物科技有限公司，编号为ATCC 13124，工作用菌株为第3代）。

1.2 方法

不同水分活度培养基的配制：分别以氯化钠、葡萄糖及甘油作为水分活度调节剂，并测定其灭菌后的水分活度值，制备不同水分活度的FTM。以3 种水分活度调节剂的质量对培养基水分活度值绘制标准曲线。

产气荚膜梭菌菌液的制备：将产气荚膜梭菌转接至FTM中，（36±1）℃厌氧培养24 h，用无菌生理盐水稀释，制备成不同浓度的菌悬液。

定性试验：按标准曲线，配制水分活度在0.90～0.99 范围内梯度为0.01 的系列FTM；同时配制不调节水分活度的FTM，作为对照组（T0）。取产气荚膜梭菌菌悬液，分别加入上述FTM 中，每管装量20 mL，使菌液浓度达到102cfu/mL。各组培养物置（36±1）℃温度条件下厌氧培养30 d，逐日观察生长情况，目测判断，浑浊表明有生长，澄清表明未生长。

定量试验：通过定性试验，初步获得产气荚膜梭菌在不同介质的FTM 中生长所需最低水分活度，选择最低水分活度附近3 个水平，即低于水分活度限值0.01（T1）、水分活度限值（T2）和高于水分活度限值0.01（T3），同时配制不调节水分活度的FTM，装量均为100 mL，接种产气荚膜梭菌菌悬液，使菌液浓度达到102cfu/mL。于（36 ± 1）℃温度条件下培养，分别于0，2，16，18，20，24，42，48，72，90，120，144 h时以TSC 培养计数。以测得平均菌落数的对数值（logcfu）对时间（t，h）作图，绘制生长曲线，重复3次。

2 结果

2.1 不同介质调节FTM 水分活度的标准曲线绘制

由图1 可知，随着氯化钠、葡萄糖和甘油质量的增加，水分活度呈下降趋势。相同水分活度时，3 种水分活度调节剂质量差异较大。当水分活度为0.98时，每100 mL FTM 中分别需要添加氯化钠3.51 g、葡萄糖13.80 g、甘油9.08 g。

图1 FTM中3种水分活度调节剂质量-水分活度标准曲线A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.1 Standard curves of quality - water activity of three water activity regulators in FTM

2.2 定性试验结果

以氯化钠、葡萄糖和甘油为水分活度调节剂的FTM 中，产气荚膜梭菌的最低生长水分活度分别为0.98，0.98，0.95。这与《美国药典》中产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度（0.95）［8］一致。

2.3 定量试验结果

产气荚膜梭菌在3 种不同水分活度调节剂中的生长曲线见图2。从生长曲线来看，以氯化钠和葡萄糖调节FTM 水分活度时，产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度均为0.98；以甘油作调节剂时为0.95，与定性试验结果一致。根据定性试验结果，以氯化钠和葡萄糖调节水分活度时，T1，T2，T3应分别为0.97，0.98，0.99，但T3与对照组水分活度相同。为保证试验完整性，并探讨产气荚膜梭菌在水分活度限值以下的生长情况，本研究中将氯化钠和葡萄糖介质中T1，T2，T3调整为0.96，0.97，0.98。

图2 不同介质FTM中产气荚膜梭菌的生长曲线A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.2 Growth curves of Clostridium perfringens in FTM with different media

由图2 可知，水分活度会影响产气荚膜梭菌的生长。产气荚膜梭菌在水分活度较高时生长较旺盛，在水分活度较低时生长缓慢，低于一定值时则停止生长甚至死亡。由图2 A和图2 B可知，产气荚膜梭菌在水分活度大于0.98时生长较快，低于0.98时不生长，且3次试验结果一致，重复性良好，表明以氯化钠和葡萄糖调节水分活度，产气荚膜梭菌最低生长水分活度为0.98。由图2 C可知，当水分活度为0.96时，生长较快，生长趋势与对照组相似；当水分活度为0.95 时，虽有生长现象，但其生长趋势明显弱于0.96，表明以甘油调节水分活度，产气荚膜梭菌最低生长水分活度为0.95。

由图2可知，水分活度与产气荚膜梭菌的菌液浓度呈正相关，产气荚膜梭菌的菌落数随水分活度的降低而减少。同时，水分活度为0.98 时，氯化钠的菌液浓度对数值略低于对照组，葡萄糖的低于氯化钠；甘油在水分活度为0.95 时的菌液浓度对数值显著低于对照组，第2次试验中表现尤为明显。不同介质调节水分活度会影响产气荚膜梭菌生长迟缓期的长短。由图2 A 可知，水分活度为0.98时，产气荚膜梭菌的迟缓期为0～20 h。由图2 B 可知，水分活度为0.98 时，产气荚膜梭菌的迟缓期为0～40 h，且其生长先短暂停滞，随着时间的延长生长繁殖逐渐恢复。由图2 C 可知，当水分活度高于0.95 时，产气荚膜梭菌生长较快，16 h 即开始对数生长期；当水分活度为0.95时，产气荚膜梭菌44 h后开始进入对数期，迟缓期时间相对较长。表明产气荚膜梭菌出现临界生长状态，与产气荚膜梭菌生长所需最低水分活度（0.95）的结果一致。

3 讨论

在厌氧培养条件下，以氯化钠和葡萄糖为水分活度调节剂，当水分活度低于0.98时，产气荚膜梭菌停止生长；以甘油为水分活度调节剂，当水分活度低于0.95时，产气荚膜梭菌停止生长。其中，产气荚膜梭菌对甘油最耐受。相同菌液接种量下，甘油的0 h 菌落数对数值高于葡萄糖，氯化钠最低。这可能是因为产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌［14］，甘油可作为厌氧菌的一种保存助剂［15］，可在一定程度上促进其生长。

大多数微生物的代谢活动需要水分子参与，水分活度降低会导致微生物的代谢活性降低［16］。本研究结果表明，随着水分活度的降低，产气荚膜梭菌的生长活性逐渐受到抑制。由生长曲线可知，产气荚膜梭菌菌液浓度的降低，停滞时间的延长，都与水分活度降低呈正相关。水分活度与微生物的生长密切相关，是判断微生物风险与控制产品质量稳定性的重要指标，但目前微生物污染控制方面的应用和研究仍属罕见［17-18］。故有必要深入研究水分活度在非无菌药品微生物检验中的应用，以缩短药品放行周期，降低库存成本和检测成本。