百菌清对土壤微生物特性和水稻生物量的影响

昝树婷，杨如意，李 静，苏楠楠，周 刚

（安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽芜湖241003）

百菌清对土壤微生物特性和水稻生物量的影响

昝树婷，杨如意，李 静，苏楠楠，周 刚

（安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽芜湖241003）

农药是集约化农业保证农产品产量的重要因素之一，但不合理的施用方法会导致农药残留、土壤结构破坏和土壤微生物特性改变等一系列问题。许多研究发现，百菌清对作物和土壤微生物具有一定的毒害和抑制作用。通过温室试验探讨了百菌清不同施用量对土壤微生物生物量、呼吸强度、代谢熵和脱氢酶活性的影响，并测定了水稻生物量。结果表明，虽然微生物数量没有明显变化，但其活力受到显著抑制，且施用剂量越高抑制越明显。试验后期脱氢酶活性逐渐增加，但仍然低于对照。虽然，百菌清没有造成水稻生物量下降，但由于研究属于短期试验，且只施用了1次百菌清，因此其环境生态学影响有可能被低估。

百菌清；基础呼吸；微生物生物量

农药是杀灭和控制农业病原生物，促进作物增产的重要保障，是维持集约化农业的重要因素之一。但是，过量或不合理的施用易导致农药残留、土壤结构破坏、土壤肥力下降、微生物活性抑制，甚至威胁人类生命安全等一系列环境、生态和健康问题。百菌清（chlorothalonil）是一种非内吸性广谱杀菌剂，对水稻、玉米、豆类等大宗农作物和林业真菌病害具有良好的防治效果。目前，国内外对百菌清在土壤、水体、作物表面的积累、迁移、转化、降解等环境行为已有大量报道［1-3］。而且有研究发现，百菌清会造成水稻等作物的氧化胁迫，对其生长、发育和产量有一定的抑制作用［4］。作为土壤生态系统的重要成员，微生物在土壤物质循环、有毒物质降解、作物生长等重要的生态过程中发挥着关键功能，微生物特性也可以敏感地指示气候和土壤环境的变化，反映土壤质量和健康状况。因此，也可以通过微生物特性的变化衡量和评价农药的生态安全性。农药施用过程中有很大一部分最终进入土壤，因此可能会改变微生物群落的组成和功能。William和Turco发现，百菌清并没有对土壤中的细菌和真菌群落造成明显影响，两类微生物的优势物种几乎没有发生变化［5］。但也有研究表明，施用百菌清对反硝化细菌、产甲烷菌等非目标微生物的数量和活性造成显著抑制，减少了N2O和CH4的排放［6］。

有大量研究探讨了百菌清对土壤中各种微生物特性的影响，但施用剂量多数是根据试验用土的重量进行设计，且百菌清与土壤直接混匀处理，忽略了在实际应用中多采用表面喷施的事实。而农药的施用方法与使用频率是决定其杀菌效力和环境生态学特征的重要因素。本研究按照建议剂量将百菌清配制成溶剂进行施用，设置了3个浓度水平，探讨了百菌清不同施用剂量对土壤微生物特性和水稻生物量的影响，从而为指导百菌清的合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验用土

试验所用土壤取自芜湖市弋江区一处水稻田（31° 17′N,118°23′E），该处稻田至少已有20年未施用百菌清。该区域属亚热带季风性气候，年均气温15～16℃，年均降水量约1200mm。土壤为冲积壤土（相当于美国农业部土壤分类系统中的Fluvents）。将0～15 cm的表层土带回实验室，去除植物残根和石块并混合均匀，取少量土壤风干并过2mm土筛，用于土壤基本理化性质测定。土壤质地采用“吸管法”测定，pH采用KCl饱和溶液（2.5∶1水土水，v/m）浸提，玻璃电极法测定；有机质采用K2Cr2O7容量法（稀释热法）测定；总磷和速效磷分别采用HClO4-H2SO4和NaHCO3浸提，钼锑抗分光光度法测定；总氮采用半微量开氏法，有效氮采用碱解扩散法测定；总钾、总铜、总镉、总铅分别采用NaOH熔融，HNO3-H2SO4-HClO4熔融火焰原子吸收分光光度法（FAAS）测定［7］。土壤主要理化性质见表1。剩余土壤室温下放置1周后，用于后续培养试验。

1.2 盆栽试验

每个盆钵（直径22 cm，高19 cm）内装入3.0 kg混匀的土壤。水稻（Oryza sativa L.）种子经0.5%的NaC-lO表面消毒10m in后用灭菌的蒸馏水冲洗2次，并置于25℃的生化培养箱内催芽。每盆播种10粒种子，待幼苗萌发后再间苗至5株。本试验所用的百菌清为75%的可湿性粉剂（广东省惠州中迅化工有限公司）。盆栽试验共设置3个浓度水平，在水稻生长1个月后一次性施加。低浓度百菌清处理为常规用量，即喷施100m L的600倍液，高浓度处理为等体积的300倍液，对照施加100m L无菌水，每个处理均设4次重复。土壤持水量通过每天浇水保持在田间持水量的75%。温室中的气温保持在18～32℃，光照为自然光，盆钵的位置每2周调换1次，减少因温室中光照、气温等条件差异对试验结果造成的干扰。

表1 试验用土基本理化性质Table1 The physiochemicalpropertiesof the soil

水稻生长2个月后进行取样。每盆取根际土300 g，其中250 g用以测定土壤微生物特性，另外50 g 105℃烘干至恒重用以测定土壤含水量，所有测定值均换算成干土的重量。水稻根部用自来水冲洗干净，并将全株分成地上、地下2个部分，105℃杀青30min，65℃烘干至恒重测定生物量。

1.3 土壤微生物生物量（microbial biomass carbon, MBC）测定

MBC采用氯仿熏蒸法（chloroform fumigationextractionmethod）测定［8］。称取相当于10 g干土的新鲜土壤，加入40m L 0.5mol/L的K2SO4溶液，振荡30 m in后通过0.45μm的微孔滤膜进行真空抽滤。另取同质量的新鲜土壤一份，真空干燥器内用氯仿熏蒸48 h，同样采用上述方法进行提取。提取液中的总有机碳（total organic carbon,TOC）通过总有机碳分析仪（TOC-Vwp,Shimadzu Scientific,Japan）测定。按照下列公式计算MBC值［9］：

其中EC为氯仿熏蒸土壤与未熏蒸土壤的TOC差值，Kec为转换系数，取0.45，W为土壤干重。

1.4 土壤基础呼吸速率（soilbasal respiration,SBR）测定

对碱液吸收法稍加修改以测定SBR［10］。具体操作是，取100 g新鲜土于密闭容器（直径9.5 cm，高12.5 cm）中25°C黑暗中培养24 h。容器中放一个2 cm高的支架，一个装有20m L浓度为0.1mol/LNaOH溶液的小烧杯置于支架上。土壤呼吸产生的CO2被NaOH吸收，并通过1mol/L的BaCl2进行沉淀。多余的碱以酚酞为指示剂，用0.1mol/L的HCl进行滴定。空白对照采用同样的装置，但不添加土壤。土壤呼吸速率根据24 h培养过程中微生物释放的CO2进行定量测定，单位为μg CO2-C/g·h。微生物代谢熵（qCO2）通过SBR除以MBC进行计算。

1.5土壤脱氢酶活性（dehydrogenaseactivity,DHA）测定

采用改进的比色法测定脱氢酶活性。以水溶性的无色氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC）作为人工电子受体，TTC还原后生成红色的三苯基甲臜（triphenylformazan,TPF），其红色越深表明脱氢酶的活性越强［11］。用0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）配制0.5%的TTC，与5 g新鲜土充分混匀，37℃下保温24 h。保温结束后向离心管中加入10m L的甲苯，在150 r/m in的速度下振荡提取1 h。提取液通过滤纸进行过滤，TPF的浓度在485 nm波长下通过分光光度计进行测定（UV757CRT,上海精密科学仪器有限公司）。制作标准曲线时以Na2S作为还原剂。

1.6数据分析

所有试验数据均采用IBM SPSSV.20.0统计分析软件（SPSS,Inc.,Chicago,IL）进行分析。数据先进行方差齐性和正态分布检验，然后进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。不同处理的均值进行LSD多重比较，所有分析均在5%的显著性水平上进行。

2 结果与分析

2.1 微生物生物量碳

如图1所示，本试验3个处理土壤中的MBC含量在2.19～2.62mg/kg之间。无论低剂量还是高剂量处理组均未对MBC造成显著影响。施用百菌清甚至对MBC有一定刺激作用，且随着浓度的增加刺激作用更加明显，处理组分别比对照增加了5.94%和19.64%。

2.2土壤呼吸和代谢熵

施用百菌清对土壤呼吸造成了非常显著的抑制（图2a,F=21.79,df=2,P＜0.01），且浓度越大抑制程度越高，低剂量和高剂量组的呼吸速率分别下降了31.58%和45.26%，但两个处理组之间没有显著差异。

代谢熵与基础呼吸的变化规律相似，施用百菌清使单位时间内单位重量的土壤微生物产生的CO2显著下降（图2b,F=17.99,df=2,P＜0.01）。随着施用量的增加抑制程度越明显，但处理组之间没有显著差异。

2.3 脱氢酶活性

图1 施加百菌清对土壤微生物生物量碳的影响Fig 1 Theeffectsof chlorothalonilapplication on soilmicrobialbiomassC

图2 施加百菌清对土壤呼吸和代谢熵的影响Fig 2 Theeffectsof chlorothalonilapplication on soilbasal respiration andmetabolic quotient

如图3所示，第4周百菌清处理后立即测定脱氢酶，其活性有所下降，但不明显。对照土壤中的脱氢酶活性呈现先增加后下降的趋势，并逐渐达到平稳状态。1周后，处理组的脱氢酶活性与对照相比均显著降低，下降程度分别达60.26%和75.72%，且两个处理组之间也有明显区别。随后，处理组脱氢酶活性逐渐上升，低剂量组酶活性恢复的速度要快于高剂量组，但均仍然显著低于对照，且施用剂量对酶活性的影响一直十分明显。

2.4 水稻生物量

施用百菌清使水稻总生物量有所增加，但未达到显著水平；从地上和地下部分的生物量来看，除低剂量处理使水稻地下部分生物量下降外，处理组生物量均有所增加，但同样未达到显著水平。

3 讨论与结论

3.1百菌清对土壤微生物的影响

图3 施加百菌清对脱氢酶活性的影响Fig 3 Theeffectsof chlorothalonilapplication on dehydrogenaseactivity

图4 施加百菌清对水稻生物量的影响Fig 4 Theeffectsof chlorothalonilapplication on thebiomass of Oryza sativa L.

导致农业病原生物的耐药性增加、污染环境，以及对非目标生物的危害是限制农药使用的重要原因。百菌清是一种广谱的杀真菌剂，但很多研究发现它对细菌、放线菌有十分明显的抑制作用［6,12］，对真菌的影响反而不明显［13］。因此，施用百菌清可能会改变土壤微生物的群落结构，但并不一定会影响到群落中的优势种群［5］。本研究发现，无论是低浓度还是高浓度处理，单次施用百菌清不会显著降低微生物数量，反而会有一定程度的刺激作用。但表征微生物活性的呼吸强度、代谢熵、脱氢酶活性等均出现显著下降，且浓度越高抑制作用越明显。Wu等也发现了同样的现象，且随着施用浓度和频次的增加，百菌清在土壤中持续的时间也会显著增加，对微生物活力的抑制趋于增强［14］。虽然，在呼吸速率和代谢熵两项指标上本研究并未发现高剂量组与低剂量组之间有显著差异，但是百菌清浓度增加肯定会延缓其在土壤中的降解，增强对微生物的毒害水平。因此，合理确定农药使用剂量对维持农业生态系统的稳定性和生态功能仍然十分重要。

很多研究也证实，百菌清会明显抑制多种土壤酶的活力［13-14］，这在本研究中也有所体现。脱氢酶是所有酶中种类最多的一类，许多研究将其作为土壤酶活性的典型代表。本研究中，脱氢酶活性的抑制在施用后一周内表现最为明显，随后逐渐提高，但在整个研究期限内都没有恢复到对照的水平。而且，两种浓度之间有显著区别，高剂量处理的恢复速度也相对较慢，这可能跟百菌清浓度高导致在土壤降解较慢，残存时间长有关。目前，国内外均有不少人在研究通过筛选、驯化或基因工程培育的特殊微生物加速百菌清的降解［15-16］。

3.2 百菌清对水稻的影响

目前，研究重心主要是农药在环境中的行为及其微生物效应，关于农药对作物生理、生长、产量和品质影响的相关研究较少。虽然有研究报道，百菌清对水稻有毒害作用，造成生物量下降［4］，但本研究未发现施用百菌清对水稻生物量产生抑制，甚至还有一定的刺激作用，但这并不能说明百菌清对水稻的生长没有影响。农药造成的氧化胁迫和脂质过氧化作用可能会引起作物DNA加合物的产生，对基因表达造成明显影响［17］。研究表明，百菌清会引起番茄细胞色素P450和谷胱甘肽S-转移酶等基因的转录量增加，但编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因和谷胱甘肽还原酶基因产生沉默［18］，从而不能减缓氧化胁迫作用。水稻的生物量可能取决于百菌清所引起的3个方面变化的总体平衡。首先，由于病原生物被杀灭本身会对水稻的生长产生一定的促进作用；其次，百菌清在生理上确实会对水稻产生一定的毒害作用，造成氧化胁迫；最后，对非目标微生物的影响也会对水稻产生一定的正或负的反馈作用。如张旭红等发现丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizal fungi,AMF）可以减弱百菌清对水稻的毒害作用，但百菌清明显抑制AMF对水稻根系的侵染。以上3方面的总效应最终决定了百菌清对水稻的影响类型。

本研究测定了不同施用剂量下百菌清对土壤微生物特性的影响，结果表明微生物数量的变化不大，但活性明显受到抑制，尤其是脱氢酶。虽然水稻生物量并未降低，但并不表示水稻没有受到百菌清的氧化胁迫。由于本研究试验周期较短，且只施用了1次百菌清，因此有可能会低估百菌清对农业生态系统的实际影响。

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Effectsof chlorothalonilapp lication on soilm icrobial propertiesand biomassof Oryza sativa L.

ZAN Shu-ting,YANG Ru-yi,LIJing,SU Nan-nan,ZHOU Gang
(Collegeof EnvironmentalScienceand Engineering,AnhuiNormalUniversity,Wuhu 241003,China)

Pesticides are essential to ensure the production of intensive agriculture,however,inappropriate use can result in severe consequences including pesticide residue,deconstruction of soil texture and changes ofm icrobial properties.Many studies found that chlorothalonil showed adverse effectson crops and soilm icrobes.We conducted a greenhouse experiment to investigate the effectsof different chlorothalonil dosages on m icrobial biomass carbon(MBC),basal respiration,metabolic quotient,dehydrogenase activity (DHA)and biomass of Oryza sativa L.The results indicated that chlorothalonil did not reduce MBC butshowed a dosage dependent suppression onm icrobialmetabolic activities.DHA tended to increase over time butstill lower than the control.A lthough,chlorothalonildid notdecrease the biomass of O.sativa but its environmentaland ecologicaleffects should notbe underestimated as thiswas a short-term experimentw ith one-time application.

chlorothalonil;basal respiration;m icrobialbiomass carbon

Q89;X171.5

A

2095－1736（2015）03－0042－04

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.042

2014-10-20；

2014-11-07

国家自然科学基金资助（41001368）

昝树婷，实验师，硕士，研究方向为污染生态学及环境修复，E-mail:shuting@mail.ahnu.edu.cn；

杨如意，副教授，硕士生导师，研究方向为污染生态学，E-mail:yangruyi@mail.ahnu.edu.cn。