黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙电流的影响*

周晓敏, 柴 花, 王伊林, 黄 侠, 赵雅君, 赵 明

(内蒙古民族大学附属医院心内科， 通辽 028000)



黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙电流的影响*

周晓敏, 柴 花, 王伊林, 黄 侠, 赵雅君, 赵 明△

(内蒙古民族大学附属医院心内科， 通辽 028000)

目的：观察黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙电流的影响，探讨黄芪总黄酮改善病毒性心肌炎小鼠血流动力学机制。方法：36只雄性Balb/c小鼠分为正常对照组、病毒性心肌炎组和黄芪总黄酮组(n=12)，病毒性心肌炎组应用柯萨奇B3病毒制作BALB /c 小鼠病毒性心肌炎模型， 7 d处死小鼠取心脏 Langendorff离体心脏逆向灌流法分离小鼠心室肌细胞，应用细胞贴附式方式记录心室肌细胞钙电流，分析对钙单通道电流的影响。结果：黄芪总黄酮组可使病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞钙通道开放时间减少，开放概率明显降低 (P<0.05)，关闭时间明显增高(P<0.05)。结论：黄芪总黄酮通过降低病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞钙通道开放时间、增加关闭时间、降低开放概率抑制心室肌细胞钙电流，抑制心肌细胞钙超载，改善病毒性心肌炎小鼠血流动力学。

黄芪总黄酮；病毒性心肌炎；单通道钙电流

total flavonoids of astragalus; viral myocarditis; single channel Ca2+current

病毒性心肌炎( viral myocarditis, VMC) 是由病毒感染引起的心肌实质或间质的局限性或弥漫性病变[1],病毒性心肌炎致使心肌收缩力下降引起的心力衰竭是病毒性心肌炎患者死亡的重要原因[2]。心力衰竭是指心肌的舒缩功能障碍而导致泵血能力降低,是多种心血管疾病的终末共同通路，死亡率高，是临床上需要解决的问题。

中药黄芪具有显著的益气强心作用。在临床上被用于治疗心绞痛、高血压、病毒性心肌炎、脑梗塞、心律失常等[3]。黄芪总黄酮(total flavonoids of astragalus，TFA)是从蒙古黄芪中分离的主要活性成分,TFA中主要含有 6种单体化合物,经光谱分析分别鉴定为B-谷甾醇(1)、芒柄花素(2)、毛蕊异黄酮(3)、B-谷甾醇-3-O-B-D-葡萄糖苷(4)、芒柄花素-7-O-B-D-吡喃葡萄糖苷(5)、毛蕊异黄酮-7-O-B-D-吡喃葡萄糖苷(6),经计算这六种化合物在TFA分离出的单体化合物中重量组合比例为23∶11∶12∶3∶22∶29[4]。本研究小组前期实验发现黄芪总黄酮可以改善病毒性心肌炎小鼠血流动力学[5]，但作用机制尚未完全阐明。本研究通过观察黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙电流的影响，研究其对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙通道开放时间、开放概率、关闭时间的作用，进而揭示黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞钙循环的作用，探讨黄芪总黄酮改善病毒性心肌炎心力衰竭小鼠血流动力学作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物药品与仪器

36只雄性Balb/c小鼠，4周龄, 体质量13～15 g；CVB3(Nancy株)购自吉林大学农牧学院实验动物中心病毒室, 病毒原液效价为10-3 TCID 50/L。膜片钳放大器200-B为美国AXON公司产品。

1.2 病毒性心肌炎BALB/c小鼠模型的制备

选清洁级雄性小鼠36只，随机分为正常对照组、病毒性心肌炎组和黄芪总黄酮组(n=12)。病毒感染组与黄芪总黄酮组腹腔内无菌注射含0.1 ml 10-950TCID CVB3，正常对照小鼠组不注射CVB3病毒而注射0.1 ml生理盐水，每日注射1次，共3 d。黄芪总黄酮组小鼠每日腹腔注射0.2 ml黄芪总黄酮20 mg/L。从注射病毒起每日观察小鼠的一般状态, 主要观察小鼠的反应，详细记录小鼠饮食, 毛色, 活动和排泄情况。

1.3 小鼠心室肌细胞急性分离方法

7 d后急性处死各组BALB/c小鼠后,迅速开胸取出心脏, 置于冰冷有钙台氏液中。行主动脉插管后固定于Langendorff灌流架上逆向灌流心脏, 有钙台氏液115 min, 无钙台氏液6 min, 酶溶液13 min, 贮存液3 min。灌流完毕后, 沿房室沟处剪下心室部分, 用眼科剪将心室肌剪成小碎块, 置于盛有贮存液的三角烧杯中, 在37℃的水浴箱中轻轻震荡10 min, 吸取上清液置于离心管中, 离心5 min后弃上清液, 加入贮存液, 于4℃的冰箱中保存备用。

1.4 单通道钙电流的记录方法

应用胶原酶常规分离小鼠心室肌细胞。玻璃微电极拉制后，在其尖端涂覆硅酮树酯(Sylgaud)，然后进行抛光，充灌电极液后细胞外液中电阻为1～2 MΩ，玻璃微电极接触到细胞的表面以后，通过负压吸引作用使电极尖端与细胞膜表面形成10 GΩ以上的高阻封接后，使微电极尖端下的细胞膜片与周围细胞膜形成电—化学绝缘，形成细胞贴附式记录方式。将保持电压设置在-50 mV，阶跃至0 mV，持续时间为1 000 ms，采样频率为1 kHz，采样32条曲线，每个细胞记录32 s，记录钳制电压下的单通道钙电流。Pclamp 6.01 程序采集、分析、处理数据用Pstat程序分析单通道总的开放时间、关闭时间、用总的记录时间除以总的开放时间计算单通道的开放概率。本实验每组共记录10个心室肌细胞单通道电流。

1.5 实验所用溶液

含Ca2+台式液成分为：(mmol/ml)：NaCl 143, KCl 5.4,CaCl2·2H2O 1.8, MgCl2·6H2O 0.5, NaH2PO4·2H2O 0.25, HEPES 5。调pH值至7.4。 无Ca2+台式液去掉上述台式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同。细胞贮存液(mmol/ml)：KOH 70， L-谷氨酸 50 ，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2·6H2O3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5， 用KOH调pH值至7.4。

记录钙离子通道溶液细胞灌流液(mmol/l)：Aspartic acid 130,KOH 100，KCl 30,MgCl2·6H2O 0.5，HEPES 10，EGTA 1， 用CsOH调pH值至7.4。电极液：(mmol/l)：BaCl250,TEA 70,EGTA 0.5,HEPES 10.用CsOH调pH值至7.4。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠的一般情况及心肌病理改变：

对照组小鼠活动正常全部存活，病毒性心肌炎组小鼠在注射CVB3 后出现竖毛、蜷缩、不喜进食、活动减少等体征, 注射CVB3后第3天起, 病毒性心肌炎组小鼠开始出现死亡,至第7天共死亡2只。对照组及黄芪总黄酮治疗组小鼠无死亡，注射CVB3后7 d，对照组及黄芪总黄酮治疗组随机处死10只，病毒性心肌炎组处死剩余小鼠。病毒性心肌炎组病变严重，外观心肌呈淡黄色，质地较软，呈松弛扩张状态状态，与正常对照组小鼠相比心脏扩大。光镜观察：对照组小鼠心肌纤维排列整齐、结构清晰，细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央，未见心肌纤维变性坏死等病理性改变。病毒性心肌炎模型组病理改变明显，可见心肌纤维排列紊乱，心肌细胞坏死和间质炎性细胞浸润，间质明显水肿。黄芪总黄酮组小鼠心肌也出现一定程度的病理变化，与病毒性心肌炎模型组比较，病变程度轻、病变范围小,心肌纤维排列尚可，结构清晰，心肌纤维间隔略增宽，间质轻度水肿，偶见淋巴细胞浸润(图1)。

Fig.. 1 Changes of mice myocardial pathology (HE ×200) A： Control group； B： Virus myocarditis group；C： Total flavonoids of Astragalus group

2.2 小鼠心室肌细胞单钙通道的特点

记录小鼠心室肌细胞单钙通道电流，先将保持电压维持在-50 mV，阶跃至0 mV，持续时间100 ms，采样32条曲线，共计3.2秒。应用6.02软件分析。钙通道的幅值为(1.03±0.09 pA，n=10)，钙通道的平均开放时间为(1.01±0.11) ms，平均关闭时间为(14.52±1.43) ms。开放概率为(13.35±4.25)%。在电极液中加入Bay k 8644(一种钙通道特异激动剂)，可明显增加单钙通道电流的平均开放时间(2.95±0.28) ms，缩短钙通道关闭时间(8.79±0.71) ms，使增加开放概率增加到(35.86±3.12)%。在电极液中加入维拉帕米(Ver) 25 μmol/L 可完全抑制单钙通道的开放，这和文献报道一致[6](图2)。

Fig. 2 Using the exponential fitting the channel mean open and the average closing time, use the formula to calculate the single channel current amplitude and the original single calcium channel curve A： Single channel current amplitude； B：Control group； C： Bay k 8644； D： Calcium current in ventricular cells of each group

2.3 病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单钙通道的变化

Fig. 3 Effect of total flavonoids of Astragalus with exponential fitting on viral myocarditis in mouse ventricular myocytes of single calcium channel mean open time and closed time

应用上述实验方法，记录对照组小鼠与注射病毒7 d后的小鼠心室肌细胞单通道钙电流，结果表明，病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单钙通道平均开放时间增加(1.28±0.78) ms，平均关闭时间缩短(11.10±1.03) ms，开放概率增加(28.33±7.41)%，与对照组图比较有显著统计学意义(图3)。

2.4 黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单钙通道的作用

应用上述实验方法，记录病毒性心肌炎小鼠+黄芪总黄酮7 d后的单通道钙电流，与对照组相比，黄芪总黄酮组小鼠心肌细胞单通道钙电流开放时间(1.28±0.36)ms缩短(P<0.05)，关闭时间(11.10±1.17)ms明显延长(P<0.05,表1,图4)。

GroupOpeningtime(ms)Closingtime(ms)Openingprobability(%)Control1.01±0.1114.52±1.4313.35±4.25BayK2.95±0.288.79±0.7135.86±3.12Virusmyocardi-tis1.95±0.479.22±1.2628.33±7.41Virus+astragals1.28±0.36*11.10±1.17*18.35±6.41*

*P<0.05vsviral myocarditis group

3 讨论

病毒性心肌炎可以造成严重后果乃至死亡,死亡原因大多是因为泵功能受损或耗竭。近来研究发现心律失常及心力衰竭发病机制都与细胞内钙超载密切相关。心肌细胞内的肌浆网可摄取和释放钙离子, 在调节胞浆内的游离钙离子方面起着重要作用, 研究表明心肌衰竭与肌浆网的异常钙调节有关[7]。引起钙超载的原因有: 心肌细胞动作电位平台期钙内流增多，内质网钙ATP酶2(SERCA2)表达减少或活性降低及肌纤维膜蛋白复合体介导的钠钙交换障碍等[8]。本研究观察到黄芪总黄酮通过降低病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞钙通道开放时间、增加关闭时间、降低开放概率抑制心室肌细胞钙电流，通过干扰细胞外Ca2+内流, 进而引起内质网钙库释放钙减少，降低细胞内Ca2+浓度而缓解了钙超载心肌损伤的程度, 促使心肌主动松弛而改善心脏舒张功能, 并间接地改善收缩性心功能不全的程度。上述机制可能是黄芪总黄酮可以改善病毒性心肌炎小鼠血流动力学机制之一。

Fig. 4 Effeces of total flavonoids of astragalus on single channel Ca2+current of ventricular myocytes in viral myocarditis group

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内蒙古自治区科技厅资助项目(2011BS1101)

2014-09-23 【修回日期】2014-10-30

R331.3；R332

A

1000-6834(2015)01-058-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.017

△【通讯作者】Tel: 13474859991； E-mail: langzhe73@163.com