金银花黄酮对小鼠免疫调节作用的研究*

皮建辉， 谭 娟， 胡朝暾， 向德标

(怀化学院生命科学系， 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室， 湖南 怀化 418008)



金银花黄酮对小鼠免疫调节作用的研究*

皮建辉△， 谭 娟， 胡朝暾， 向德标

(怀化学院生命科学系， 民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室， 湖南 怀化 418008)

目的：探讨金银花黄酮对小鼠血清免疫酶活性与淋巴器官的抗氧化作用。方法：将50只昆明小鼠随机分为5组(n=10)：正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。模型组和正常组小鼠生理盐水灌胃，低、中、高剂量组分别给予金银花黄酮100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg体重灌胃。连续灌胃7周后，除正常组注射生理盐水，其他各组小鼠均采用25 mg/kg体重的地塞米松连续3 d皮下注射，造成免疫抑制后继续灌胃1周，处死全部小鼠，取血和胸腺、脾脏，称重胸腺和脾脏，计算小鼠脏器指数，测定血浆中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)活力，以及胸腺和脾脏匀浆中单胺氧化酶(MAO)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。结果：金银花黄酮能显著提高免疫抑制小鼠的脏器指数，增加免疫抑制小鼠血清ACP、AKP和LSZ活力，提高免疫抑制小鼠的脾脏、胸腺组织T-AOC和SOD活性，而明显降低MAO和MDA含量。结论：金银花黄酮能显著调节小鼠血清免疫酶活性，提高淋巴器官的抗氧化功能，表明具其有良好的免疫调节功能。

金银花黄酮；脏器指数；免疫酶活性；抗氧化作用

植物黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具有许多重要的生理、生化作用，是许多中草药的重要有效成分。金银花(LoniceraJapanicaThunb)为忍冬科多年生半常绿缠绕植物忍冬的花蕾，含有木犀草素、异绿原酸、绿原酸和黄酮等多种化合物。现代药理学研究表明，金银花黄酮类化合物具有明显的抗氧化作用[1]，但其他相关的生物学活性研究甚少。本实验通过探讨金银花黄酮对小鼠血清免疫酶活性与淋巴器官的抗氧化损伤作用，揭示其免疫调节功能，为金银花的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与主要仪器

金银花采自怀化中坡山，经鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬的花蕾。试验动物采用体重22～25 g的清洁级KM小鼠，购自中南大学实验动物中心，许可证号：SCXK(湘)2009-0004。试剂：地塞米松(Dexamethasone，Dex，购自郑州卓峰有限公司，批号：1010721)；肝素钠(购于怀化解放军五三五医院)；酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、溶菌酶(lysozyme，LSZ)、单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其他药品均为国产分析纯。主要使用仪器：EU800紫外/可见光分光光度计(美国贝克曼)、WFH-203紫外分析仪(上海精科实业有限公司)。

1.2 金银花总黄酮的提取及其纯度测定

金银花黄酮(LoniceraJaponicaflavone)的提取参照文献[2]进行。用芦丁做黄酮的标准品，经光谱分析测定其最大吸收波长为510 nm。用最小二乘法作线性回归，得吸光值(A510 nm)与芦丁浓度(mg/ml)的线性回归方程为：y=2.1387x-0.0009，R2=0.9999，线性范围为：0.1096～1.0965(mg/ml)。配制2 mg/ml的金银花黄酮粉溶液，测得A510 nm平均值为x=0.5766，代入标准方程y=2.1387x-0.0009，得y=1.2323 mg/ml，故金银花黄酮粉中总黄酮含量(纯度)为61.61%。

1.3 动物实验

选取体重22～25 g的清洁级KM小鼠50只，随机分为5组，每组雌雄各半(n=10)：模型组、正常组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。模型组和正常组小鼠生理盐水灌胃，高、中、低剂量组分别给予金银花黄酮按照100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg体重灌胃。连续灌胃7周后，除正常组注射生理盐水，其他各组小鼠均采用Dex(25 mg/kg体重)连续3 d皮下注射，造成免疫抑制后继续灌胃1周。

1.4 生理生化指标测定

1.4.1 脏器指数计算 Dex致敏(同时灌胃)一周后禁食不禁水12 h，称量体重，摘眼球采血后引颈处死小鼠，迅速解剖，分别将离体脾脏、胸腺用蒸馏水清洗表面，用滤纸吸干称重，以小鼠脏器质量(mg)/体重(g)计算各脏器指数。

1.4.2 小鼠血清免疫酶活性测定 小鼠活体摘眼球取血，将血滴入事先用肝素钠处理过的无菌离心管中，轻轻摇匀后3 000 r/min、4℃离心10 min后取上清，严格按照试剂盒说明书分别测定ACP，AKP，MPO，LSZ。

1.4.3 小鼠淋巴器官抗氧化指标测定 分别将脾脏、胸腺剪碎，用冰生理盐水制成10%的匀浆，3 000 r/min、4℃离心10 min后取上清，严格按照试剂盒说明书分别测定脾脏、胸腺的MAO、T-AOC、SOD、MDA。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 金银花黄酮对小鼠脏器指数的影响

动物实验后，各实验组间的动物体重没有明显变化，说明动物体重不受Dex和金银花黄酮影响。与正常组相比，模型组小鼠各脏器指数极显著性降低(P<0.01)；低剂量组脏器指数极显著低于正常组(P<0.01)，中、高剂量组的脏器指数与正常组均无显著的统计学差异。与模型组相比，除低剂量组胸腺指数没有明显差异外，其他各剂量组脏器指数显著性升高(P<0.01)；可见Dex会损伤小鼠脾脏、胸腺组织，降低小鼠脾脏、胸腺脏器指数，小鼠灌胃金银花黄酮后能有效地提高各剂量组小鼠脏器指数，表明金银花黄酮对各剂量组脾脏、胸腺具有明显的保护作用。

GroupDose(mg/kg)Spleen ThymusControl—3.36±0.122.28±0.13Model—2.26±0.11**2.05±0.12**Lowdose1002.67±0.13**2.02±0.13**Middledose2003.28±0.15##2.22±0.12##Highdose4003.34±0.16##2.85±0.13##

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

2.2 金银花黄酮对小鼠血清免疫酶活性的影响

GroupDose(mg/kg)ACP(U/100ml)AKP(U/100ml)LSZ(u/mgprot)ControlModelLowdoseMiddledoseHighdose——10020040023.75±1.986.03±0.60**9.85±1.28##16.95±2.40##22.13±1.28##7.25±1.483.63±0.58**7.28±1.58##8.09±1.17##12.73±3.50##6.30±0.074.31±0.07**6.71±0.97##12.61±0.05##13.63±0.86##

ACP：Acid phosphatase；AKP：Alkaline phosphatase；LSZ：Lysozyme

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

2.3 金银花黄酮对小鼠淋巴器官抗氧化损伤的作用

与正常组相比，模型组小鼠脾脏、胸腺组织中MAO、MDA含量均极显著性升高(P<0.01)，而T-AOC、SOD明显降低(P<0.01)；与模型组相比，金银花黄酮各剂量组小鼠脾脏、胸腺组织中MAO、MDA含量均显著性降低(P<0.05，P<0.01)，而T-AOC、SOD明显升高(P<0.01，表3、表4)。可见，金银花黄酮能抵抗Dex所造成的淋巴器官组织氧化损伤。然而，相对正常组来说，各剂量组整体来说还不能完全恢复Dex所致淋巴组织的氧化损伤。

Tab. 3 Effect of Lonicera Japonica flavone on MAO、T-AOC、SOD、MDA in spleen of mice(±s, n=10)

MAO： Monoamine oxidase； T-AOC： Total antioxidant capacity； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 4 Effect of Lonicera Japonica flavone on MAO、T-AOC、SOD、MDA in thymus of mice(±s, n=10)

MAO： Monoamine oxidase； T-AOC： Total antioxidant capacity； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

3 讨论

植物活性成分的免疫调节作用通常考察淋巴细胞转化率、巨噬细胞吞噬力、溶血素抗体生成、NK细胞活性、血清IL-2与IFN-α水平等[3-5]。本研究通过考察免疫酶活性与淋巴器官的抗氧化来探讨植物活性成分的免疫调节作用，为免疫调节分析提供了新的分析思路。

机体的免疫功能可比较客观地反映机体内脏器官，特别是免疫器官的发育状况。当机体整体免疫功能增强时，内脏器官重量有所增加，其脏器指数也随之升高。Dex对小鼠所造成的免疫抑制明显降低了脾脏与胸腺的脏器指数，但金银花黄酮灌胃能提高各脏器指数，表明金银花黄酮能抑制Dex对小鼠脾脏与胸腺细胞所造成的免疫损伤。

ACP、AKP和LSZ是生物体内重要的非特异性免疫因子，与生物的免疫水平密切相关。ACP具有清除、消化、水解异物的作用，在血液和血细胞中有重要的防御功能[6]；AKP是解毒系统的主要酶之一，可作为机体非特异性免疫指标来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫功能的影响[7]；血清LSZ是由单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞合成分泌的，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有增强机体的抵抗力的作用[8]。本研究中，金银花黄酮能改善Dex所致免疫抑制小鼠血清中ACP、AKP、LSZ等免疫相关酶的活力，表明金银花黄酮具有较明显的免疫活性调节作用。

机体内有一套完整的抗氧化防御体系，能防止自由基链式反应的氧化损伤，这一体系有类似于免疫系统的作用。MAO是能够选择性代谢(氧脱氨基)单胺类物质的一类酶，在人体内分布极广，它能够分解5-羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等[9]。T-AOC 是机体清除自由基的重要指标，它的测定结果克服了单一的抗氧化指标难以全面反映组织抗氧化能力的不足[10]。MDA 是氧自由基攻击生物膜不饱和脂肪酸的终产物，淋巴器官匀浆中MDA 含量的变化可反映淋巴器官中细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS) 的情况[11]，当淋巴细胞中ROS含量增加时，细胞内的蛋白质、脂类、DNA等生物大分子将受到明显损伤，导致淋巴细胞功能下降，甚至威胁细胞的生存[12]；SOD是细胞内源性的抗氧化酶类，它可通过代谢转化将细胞内的ROS转变为相对低毒性的物质，保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用[11,13]。本研究结果显示，Dex所致免疫抑制小鼠脾脏、胸腺组织中MAO明显升高、T-AOC明显降低，表明此时脾脏、胸腺组织受到明显的过氧化损伤，但金银花黄酮灌胃后，脾脏、胸腺组织中的MAO与T-AOC明显改善。同时，金银花黄酮能显著提高Dex所致免疫抑制小鼠脾脏、胸腺中SOD的活力，保护淋巴细胞免受过氧化损伤，明显降低MDA含量，说明金银花黄酮具有良好的抗氧化损伤作用，可以通过调节机体内脂质过氧化程度而提高机体免疫能力。

[1] 刘昌平. 金银花黄酮的抗氧化活性分析[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(20): 9483-9484,9505.

[2] 李晓军. 超声波辅助提取金银花黄酮类化合物的研究[D]. 西安: 陕西师范大学, 2009.

[3] 易有金, 胡 瞬, 熊兴耀, 等. 灵芝孢子油对免疫低下模型小鼠的免疫调节作用[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2013, 39(2): 161-166.

[4] 史 敏, 崔 芳, 杨长瑛, 等. 慢性间歇性低压低氧对大鼠免疫功能的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2009, 25(4): 433-438.

[5] 曾 阳, 鲍 敏, 马继雄, 等. 翁布总黄酮对佐剂性关节炎大鼠的免疫调节机制[J]. 中国药理学通报, 2011, 27(4): 504-507.

[6] Bull H, Murray PG, Thomas D,etal. Acid phosphatases[J].MolPathol, 2002, 55(2): 65-72．

[7] Ammons J, Ahmed N, El-sheemy M,etal. The role of BMP-6, IL-6, and BMP-4 in esenchymal stem bone development: effects on osteoblastic differentiation induced by parathyroid hormone and Vitamin D[J].StemCellDev, 2004, 13(3): 273-280.

[8] 张 鹏, 江明锋, 王 永. 动物源溶菌酶研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2012, 32(8): 87-93．

[9] 孙 伟, 苗珍花, 王亚玲, 等. 宁夏枸杞叶对自然衰老小鼠的抗疲劳作用[J]. 宁夏医科大学学报, 2011, 33(3): 204-206.

[10]Doreswamy K, Shrilatha B, Rajeshkumar T,etal. Nickel-induced oxidative stress in testis of mice: evidence of DNA damage and genotoxic effects[J].JAndrol, 2004, 25(6): 996-1002．

[11]何 玲, 孙桂波, 孙 潇, 等. 木犀草苷对阿霉素诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2012, 28(9): 1229-1234.

[12]何云凌, 吴丽颖, 黄 欣, 等. 自噬对不同低氧条件下PC12细胞存活的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, 29(3): 193-196.

[13]孙桂波, 王 敏, 高蒙蒙, 等. 龙牙木总皂苷对 H2O2诱导乳鼠心肌细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(6): 773-777.

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本刊编辑部

Effects ofLoniceraJaponicaflavone on immunomodulation in mice

PI Jian-hui△， TAN Juan， HU Zhao-tun, XIANG De-biao

(Department of Life Science, Huaihua University, Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources；Laboratory of Hunan Higher Education for Hunan-Western Medicinal Plant and Ethnobotany， Huaihua 418008, China)

Objective: To study immunomodulating activity ofLoniceraJaponicaflavone by investigating immune enzymatic activity of serum and ant-ioxidized activity of lymphoid organs in mice. Methods: Fifty KM mice were randomly divided into control group, model group, low dose group, middle dose group and high dose group(n=10), respectively. And low dose group, middle dose group and high dose group were givenLoniceraJaponicaflavone with 100 mg/kg, 200 mg/kg and 400 mg/kg every day, respectively, while control group and model group were administered with NS. After continuously giving drug 7 weeks, other groups were injected with Dexamethasome (Dex: 25 mg /kg) for 3 days by subcutaneous injection, but the control group were treated with NS. And after givingLoniceraJaponicaflavone 1 week simultaneously, organ indexes , the activity of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP) and lysozyme (LSZ) in serum , and the content of monoamine oxidase (MAO), total antioxidant capacity (T-AOC), total superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in lymphoid organs in mice were tested, respectively. Results:LoniceraJaponicaflavone could significantly improve the organ indexes, and significantly improve the activity of ACP、AKP and LSZ in serum, and significantly improve the contents of T-AOC and SOD, but reduce that of MAO and MDA in lymphoid organs in immunosuppressed mice. Conclusion:LoniceraJaponicaflavone can significantly improve the activity of immune enzyme in serum and the anti-oxidized activity of lymphoid organs in mice. It suggests thatLoniceraJaponicaflavone has a good immunomodulatory effects.

LoniceraJaponicaflavone； organ index; Immune enzymatic activity; anti-oxidized activity

湖南省重点学科建设项目(湘教发[2011]42号)；“民族药用植物活性成分高效利用”湖南省高校创新团队培育项目(2012A01)

2014-07-10 【修回日期】2014-10-24

R392.1，R967

A

1000-6834(2015)01-089-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.026

△【通讯作者】Tel: 13574578248; E-mail: pijh817@126. com