Survivin和Ki67在胰腺内分泌肿瘤中表达及预后价值的评估*

刘网网， 郑 怡， 夏作利， 张士锵， 鲍 方， 林中民， 姬秀焕， 应丽丽，赵灵灵， 徐梦菲， 蔡国平△， 陈国荣△

(1. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江温州 325000； 2. 安庆市第一人民医院病理科， 安徽安庆 246004)



Survivin和Ki67在胰腺内分泌肿瘤中表达及预后价值的评估*

刘网网1， 郑 怡1， 夏作利1， 张士锵1， 鲍 方2， 林中民1， 姬秀焕1， 应丽丽1，赵灵灵1， 徐梦菲1， 蔡国平1△， 陈国荣1△

(1. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江温州 325000； 2. 安庆市第一人民医院病理科， 安徽安庆 246004)

目的：探讨Survivin及Ki67与胰腺内分泌肿瘤(PETs)临床病理特征和预后的关系。方法：免疫组化检测25例正常胰腺组织和81例PETs组织芯片中Survivin、Ki67的表达情况，并分析其与预后的关系。结果：①PETs中Survivin、Ki67表达显著高于正常胰腺组织(P<0.01)；②Survivin及Ki67在PETs中的表达均与病理分级和TNM临床分期有关(P<0.05)，与肿瘤大小、发生部位及功能分类无相关性。另外，胞核Survivin阳性表达与淋巴结转移具有相关性(P<0.05)；③Ki67高增殖指数与胞核Survivin阳性表达显著相关，与胞浆Survivin相关性无统计学意义。结论：Survivin和Ki67在PETs中均有表达，并且与PETs的临床病理特征关系密切，可作为评判PETs预后的新型指标。其中，胞核Survivin的阳性表达较胞浆阳性表达更具有诊断意义，其与淋巴结转移显著相关，是提示PETs预后不良的重要依据。

胰腺内分泌肿瘤；Survivin；Ki67；预后

胰腺内分泌肿瘤(pancreatic endocrine tumors，PETs)是一种罕见的消化系统内分泌肿瘤，发病率约1/10万。此类肿瘤多为良性，而胰腺外组织、器官发生侵犯或淋巴结转移，是PETs判断生物学行为良恶性的重要依据。此外，一些报道中将肿瘤大小、核分裂象数、有无周围血管神经侵犯、Ki67增殖指数视为评估患者预后的指标，但并未达成统一观点[1]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)中的一员，在肾、肝、消化道等多个部位癌组织中检测到高水平表达。Ki67是一类与细胞增殖有关的核抗原，其功能与有丝分裂关系密切，在多种恶性肿瘤中表达，表达范围覆盖除G0期以外的各增殖周期的细胞核。本研究通过组织芯片技术建立一个PETs样本系列，免疫组化测定Survivin、Ki67的表达，研究其与临床病理特征及预后的关联性。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集1998～2011年温州医科大学附属第一医院存档的PETs 18例及由耶鲁大学医学院提供的PETs 63例，所选病例患者经粗针穿刺或外科手术均有完整临床资料，选取的蜡块经病理医师镜检及免疫组化神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、嗜铬粒蛋白A(chromogranin A，CgA)、突触素(Synaptophysin，Syn)检测确定。部分难以确定的石蜡标本转制成电镜标本，观察有无分泌颗粒以确定。另选25例肿瘤旁正常胰腺组织作为对照。

1.2 主要试剂

兔抗人单克隆抗体(Survivin)、鼠抗人单克隆抗体(Ki67)工作液及免疫组化PV-6000试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

1.3 透射电镜标本制备

取标本0.1 cm厚切片，剔除肿瘤周边组织，制成约0.5×0.5×0.1 cm3大小的蜡片，二甲苯脱蜡，丙酮梯度水化，0.1 mmol/L PBS缓冲液漂洗15 min×3次，1%锇酸后固定1 h，0.1 mmol/L PBS缓冲液10 min，双蒸水10 min×2次，1%醋酸铀1 h，丙酮梯度脱水，环氧树脂浸透包埋，半薄切片定位后80 nm超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色，日立H-7500透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)下观察并拍照[2]。

1.4 组织芯片的制备

81例标本蜡块经HE染色、阅片，选取典型肿瘤组织区域，在样本蜡块上用记号笔标记。制备2 cm×2 cm的模板蜡块，用针孔直径为2 mm的芯片制作仪在模板蜡块上打孔。根据样本蜡块上的标记，在对应部位打孔采集组织芯粒并转移至模板蜡块孔中，每例标本取两个点。组织芯粒全部插入后，将模板蜡块置于烘箱(70℃)2 min，取出后压平表面，再4 μm连续切片，制成组织芯片。

1.5 免疫组化

采用Envision二步法，切片常规脱蜡水化后，3%H2O2室温阻断10 min，高压锅煮沸抗原修复2 min，自然冷却；Survivin、Ki67采用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)配制；滴加即用型一抗，4℃过夜；切片常温下复温30 min，滴加二抗，37℃ 20 min；DAB显色，水洗，苏木素复染，常规脱水，中性树胶封片。

1.6 结果判定

透射电镜下观察肿瘤细胞内有无分泌颗粒，若出现分泌颗粒则可以确定属于PETs，否则予以排除。Survivin以肿瘤细胞内出现黄色为阳性表达，根据Survivin阳性细胞数：≤5%为阴性，5%～50%为阳性，>50%为强阳性，胞核与胞浆评定标准一致[3]。Ki67以胞核内棕黄细颗粒染色为阳性细胞。在高倍镜下随机选取5个视野，计数至少1 000个肿瘤细胞，计算Ki67阳性细胞百分比，即增殖指数，≤2%为低增殖指数，>2%为高增殖指数[4]。

1.7 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计分析软件进行统计学分析，用χ2检验分析Survivin及Ki67与临床病理特征的联系，用Spearman秩相关检验分析Survivin与Ki67增殖指数、WHO病理学分级和TNM分期的相关性。

2 结果

2.1 临床资料

81例PETs中，男34 例，女47 例，年龄范围(11～84)岁，平均(54.6±13.2)岁。肿块直径0.4～15 cm，平均直径3.4 cm，直径≥2 cm者50例。肿瘤位于胰头22例，胰体21例，胰尾38例。其中，高分化内分泌肿瘤42例，良恶性未定的内分泌肿瘤21例，高分化内分泌癌13例，低分化内分泌癌5例。根据2013年中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理诊断共识专家组意见[5]对PETs进行分级可分为G1级42例，G2级21例，G3级18例。按临床TNM分期[6]，Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期14例，Ⅳ期16例。

2.2 TEM下肿瘤细胞的超微结构

肿瘤细胞胞核较规则，核内染色质稍深染，无明显染色质紊乱、边集等现象发生。瘤细胞胞质内含有大量神经内分泌颗粒，体积大小不一，直径150～200 nm，200 nm以上的神经内分泌颗粒形态变化为空泡状结构，与周围分界明显(图1)。

Fig.. 1 Transmission electron microscopy of the tumor cells A:×10 k； B: ×15 k

2.3 不同WHO分级和TNM分期的PETs中Survivin和Ki67的表达情况

根据肿瘤的WHO分级和TNM分期， PETs中Survivin和Ki67的表达情况具体见图2(图2，见彩图页Ⅴ)。

2.4 Survivin的表达与临床病理特征的联系及其与WHO分级和TNM分期相关性的比较

81例PETs中，Survivin在肿瘤细胞的胞浆和胞核部位都有表达，胞核染色强度较胞浆略强，正常胰腺内无表达(图3，见彩图页Ⅴ)。其中，胞核Survivin表达呈强阳性4例，阳性23例，阴性54例，其阳性表达与肿瘤病理学分级(P<0.01)、临床TNM分期(P<0.05)及肿瘤邻近器官转移(P<0.05)具有相关性，另外与淋巴结转移具有显著相关性(P<0.05)；胞浆Survivin呈强阳性表达11例，阳性29例，阴性41例，阳性表达与病理学分级(P<0.01)、临床TNM分期(P<0.01)具有相关性，并与肿瘤邻近器官浸润显著相关(P<0.01)，而与淋巴结转移无相关性。另外，Survivin在PETs中与年龄、性别、肿瘤大小、发生部位及功能分类均无相关性。

2.5 Ki67的表达与临床病理特征的联系及其与WHO分级和TNM分期相关性的比较

Ki67在PETs中阳性细胞百分比范围为0～40%，Ki67呈高增殖指数30例，低增殖指数51例(图4，见彩图页Ⅴ)。其与肿瘤WHO分级(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)及淋巴结转移(P<0.05)具有相关性，而与肿瘤毗邻器官浸润无相关性。此外，Ki67在PETs中与患者年龄、性别、肿瘤大小、发生部位及功能分类无相关性。

2.6 Survivin的表达与Ki67增殖指数相关性的比较

Ki67增殖指数与胞核Survivin表达具有高度相关性(P<0.01)，而与胞浆Survivin表达无相关性。

3 讨论

PETs是一种起源于胰腺管内原始多能神经干细胞的肿瘤，临床罕见，占所有胰腺肿瘤的1%～2%，病程发展缓慢，一般预后较好。然而由于其发生位置隐蔽，少部分低分化肿瘤在发现时就已发生转移，且预后不良，五年生存率不足1%[7]。现阶段判断PETs的生物学行为仍未有统一的标准。肿瘤组织学类型、原发灶大小、有无远处转移、是否为根治性切除等是影响患者预后的主要因素，核分裂率和坏死也有一定的参考价值。目前，关于PETs的WHO分级标准由Capella等在2000年提出并随后进行了多次修改，此标准是建立于专家的统一意见而并非是大量临床数据基础之上，国际上尚未形成一致标准[8]。因此，我们应寻找更可靠的指标用于提高PETs预后评估的效率。

IAPs是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族，主要通过抑制Caspase活性发挥抗凋亡作用，其抗凋亡作用远强于Bcl-2家族[9]。目前已发现8个人类IAPs家族成员，其中Survivin是作用最强的凋亡抑制因子，其作为预后不良的标记已在乳腺癌、肾癌、食管癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中有过大量报道[10]。已有研究表明，Survivin在神经内分泌肿瘤中表达是指示预后不良的一个有价值的生物学标记[4]，其阳性表达与mTOR、VEGF等多种信号通路相关[11]。本实验中，胰腺内分泌癌Survivin阳性表达率高于Ki67呈高增殖指数的病例，说明Survivin对胰腺内分泌癌的敏感性较Ki67更高。Survivin在胞浆内阳性表达例数较胞核内阳性表达例数更多，这一现象可能是由Survivin在胞核与胞浆中作用方式及功能性不同所致[12]。而胞核的表达在胰腺内分泌癌中阳性率较胰腺内分泌瘤更高，且Survivin在胞核中的阳性表达与淋巴结转移高度相关，而胞质阳性与其无统计学意义，提示核Survivin的阳性表达是指示预后不良的指标。根据Ekeblad[3]等的结果，随着神经内分泌肿瘤的进展，核Survivin的表达上调，pNECs核Survivin阳性患者生存期限明显短于分化较好的阳性患者。另外，Survivin在肿瘤调控细胞增殖与抑制凋亡过程中可以产生Survivn-ΔEx3、Survivn-2B等大量的剪接变异体，在一些肿瘤中可能对Survivn本身的功能产生影响[13]，是否同样对PETs的预后具有诊断价值，尚需进一步研究。

Ki67作为定位于细胞核的与细胞增殖相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，但具体作用机制尚不明确[14]。多数学者研究认为Ki67的表达与肿瘤的临床病理分级相关性较高，随着Ki67表达水平的增高，临床疗效及预后就越差。因此，一些报道将Ki67作为PETs的独立评估因子，但其在PETs中敏感度和特异性不高，能否作为评价预后的标准目前仍未有统一意见。根据Alexiev[4]等报道，PETs的病理分级和Ki67增殖指数及肿瘤大小、局部组织转移间并没有明显关联。Grabowski[15]的研究显示，Ki67高增殖指数并不能作为判断PETs患者预后的主要指标。同时研究分析表明，如果将Ki67作为影响预后的唯一因素，对比PETs患者Ki67高增值指数与低增值指数生存时间，K.M.生存分析曲线并无统计学差异。如果将核Survivin及Ki67两变量联合分析，则K.M生存分析曲线有变化且对预测预后有意义。本实验研究表明核Survivin阳性表达与Ki67增殖指数具有高度相关性，提示Survivin可能通过抑制凋亡，使肿瘤细胞处于高增殖状态，促进肿瘤侵袭、转移。因此，核Survivin阳性表达联合Ki67高增殖指数可以作为判断PETs侵袭力和预后的重要指标。

综上所述，Survivin和Ki67均可在PETs中表达。其中，Survivin在胞浆内阳性表达提示肿瘤具有侵袭性，而胞核阳性表达更明确的指示肿瘤预后不良。胞核Survivin阳性表达与淋巴结转移高度相关，是提示预后不良的重要依据，同时，其与肿瘤细胞增殖指数Ki67具有显著相关性，且与肿瘤的发展和转移密切相关，可作为早期诊断PETs及判断预后的新型指标。

[1] Scarpa A， Mantovani W， Capelli P，etal. Pancreatic endocrine tumors: improved TNM staging and histopathological grading permit a clinically efficient prognostic stratification of patients[J].ModPathol， 2010， 23(6): 824-833.

[2] 林中民， 焦立卓， 郑 怡， 等. 姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用及其机制探讨[J]. 中国应用生理学杂志， 2014， 30(1): 38-42.

[3] Ekeblad S， Lejonklou MH， Stalberg P，etal. Prognostic relevance of survivin in pancreatic endocrine tumors[J].WorldJSurg， 2012， 36(6): 1411-1418.

[4] Alexiev BA， Drachenberg CB， Papadimitriou JC. Endocrine tumors of the gastrointestinal tract and pancreas: grading, tumor size and proliferation index do not predict malignant behavior[J].DiagnPathol， 2007， 2: 28.

[5] 2013年中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理诊断共识专家组. 中国胃肠胰神经内分泌肿瘤病理诊断共识(2013版)[J]. 中华病理学杂志， 2013， 42(10): 691-694.

[6] Rindi G， Falconi M， Klersy C，etal. TNM staging of neoplasms of the endocrine pancreas: results from a large international cohort study[J].NatlCancerInst， 2012， 104(10): 764-777.

[7] Ehehalt F， Saeger HD， Schmidt CM，etal. Neuroendocrine tumors of the pancreas[J].Oncologist， 2009， 14(5): 456-467.

[8] Goh BK， Chow PK， Tan YM，etal. Validation of five contemporary prognostication systems for primary pancreatic endocrine neoplasms: results from a single institution experience with 61 surgically treated cases[J].ANZJSurg， 2011， 81(1-2): 79-85.

[9] 郑鸣之， 蒋建平， 傅 林， 等. 低温保存诱导大鼠心肌细胞Smac/DIABLO蛋白表达的动态变化[J]. 中国应用生理学杂志， 2009， 25(3): 296-299.

[10]Stasikowska-Kanicka O, Wagrowska-Danilewicz M, Danilewicz M. Immunohistochemical study on survivin in sinonasal tumors and its relationship with the immunoexpression of Ki67 and Bcl-2[J].FoliaHistochemCytobiol， 2013， 51(3): 225-231.

[11]Kanwar JR， Kamalapuram SK， Kanwar RK. Survivin signaling in clinical oncology: a multifaceted dragon[J].MedResRev， 2013， 33(4): 765-789.

[12]Mahotka C， Liebmann J， Wenzel M，etal. Differential subcellular localization of functionally divergent survivin splice variants[J].CellDeathDiffer， 2002， 9(12): 1334-1342.

[13]Zheng WY, Kang YY, Li LF,etal. Levels of effectiveness of gene therapies targeting survivin and its splice variants in human breast cancer cells[J].DrugDiscovTher, 2011, 5(6): 293-298.

[14]陈国荣， 刘 毅， 毛孙忠， 等. 黄芪对糖尿病性肾病大鼠心肌脂质过氧化作用及一氧化氮水平的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2001， 17(2): 186-188.

[15]Grabowski P, Griss S, Arnold CN,etal. Nuclear survivin is a powerful novel prognostic marker in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor disease[J].Neuroendocrinol, 2005, 81(1): 1-9.

声 明

《中国应用生理学杂志》2014年第30卷第5期471～474页发表的白春宏，刘浩，李双英，彭朋，宁丽娜的《骶神经电刺激对脊髓损伤大鼠肠黏膜机械屏障的保护作用》一文，其基金项目为国家自然科学基金青年项目(81101441)、武警后勤学院博士启动金课题(WHB201213)和武警医学院附属医院科研种子基金(FYM201111)，特此声明。

The study of the expression and the prognostic value of Survivin and Ki67 in pancreatic endocrine tumors

LIU Wang-wang1， ZHENG Yi1， XIA Zuo-li1， ZHANG Shi-qiang1， BAO Fang2， LIN Zhong-min1， JI Xiu-huan1，YING Li-li1， ZHAO Ling-ling1， XU Meng-fei1， CAI Guo-ping1△， CHEN Guo-rong1△

(1. Department of Pathology， the First Affiliated Hospital， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000; 2. Department of Pathology， the First People’s Hospital of Anqing City， Anqing 246004， China)

Objective: To explore the relationship between the expression of Survivin and Ki67 with prognosis of pancreatic endocrine tumors (PETs). Methods: Immunohistochemistry for Survivin and Ki67 was performed in 25 cases of normal pancreatic tissues and 81 cases of PETs by tissue microarrays and to observe the expression and evaluate the relationship with prognosis. Results: ①The expression of Survivin and Ki67 in PETs was significantly higher than that in normal pancreatic tissues (P<0.01); ②The expression of Survivin and Ki67 in PETs was correlated with tissue grading and the TNM-staging (P<0.05), but not related with tumor size、location and functional status. In addition, the expression of nuclear Survivin was association with lymph node metastasis (P<0.05). ③The high expression of Ki67 was related with the expression of nuclear Survivin, but not related with the expression of cytoplasmic Survivin. Conclusion: Survivin and Ki67 were both expressed in PETs, which were closely related to the clinical pathological characteristics. They could be used as new indicators in the evaluation of prognosis of PETs. The expression of Survivin in nucleus had more diagnostic significance than that in cytoplasm, and that could be highly correlated with lymph node metastasis, which would be used as a new marker of poor prognosis.

pancreatic endocrine tumors； Survivin； Ki67； prognosis

浙江省科技厅国际合作项目(2013C24031)；浙江省自然科学基金资助项目(LY12H26002)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-27

R736.7

A

1000-6834(2015)01-072-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.021

△【通讯作者】Tel： 0577-55579795； E-mail： guopingcai@yahoo.com; chengr1978@aliyun.com