阿魏酸钠对幼大鼠心肌柔红霉素损伤的保护作用*

连加辨， 吴枝娟， 方秋娟△， 余 靖， 何瑞岚

(1. 三明职业技术学院基础医学教研室， 福建 三明 365000；2. 福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系， 福州 350004)



阿魏酸钠对幼大鼠心肌柔红霉素损伤的保护作用*

连加辨1，2， 吴枝娟2， 方秋娟2△， 余 靖2， 何瑞岚2

(1. 三明职业技术学院基础医学教研室， 福建 三明 365000；2. 福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系， 福州 350004)

目的：探讨阿魏酸钠对幼龄大鼠心肌柔红霉素(DNR)损伤的保护作用。方法：雄性幼SD大鼠40只，随机分成4组(n=10):对照组(Control)、柔红霉素组(DNR) 、阿魏酸钠干预组(DNR+SF)和阿魏酸钠单用组(SF)。采用腹腔注射DNR每周1次，连续4周，累积剂量10 mg/kg法建立未成熟心肌DNR损伤模型，于第1次注射DNR开始，每日SF(60 mg/kg)连续灌胃25 d。通过左心室插管测左心室压力及其对异丙肾上腺素反应；观察大鼠心肌超微结构改变；Western blot 和RT-PCR 测大鼠心肌肌钙蛋白I(cTNI) 表达。结果：SF干预抑制DNR损伤引起的心率下降(P<0.05)；增加大鼠左心室舒张末期压力(LVEDP)、心率(HR)、左心室最大收缩速度(LVP+dp/dtmax)和左心室最大舒张速度(LVP-dp/dtmax)对异丙肾上腺素激发的增量(P<0.01)；改善心肌细胞超微结构损伤；抑制DNR损伤引起的心肌肌钙蛋白I表达下降(P<0.05)。结论：阿魏酸钠干预能减轻柔红霉素所致幼龄大鼠心力储备下降，可能与阿魏酸钠能有效逆转DNR致幼大鼠心肌收缩舒张相关蛋白cTNI表达下降有关。

阿魏酸钠；柔红霉素；心肌保护；异丙肾上腺素

以柔红霉素(daunorubicin, DNR)为代表的蒽环类药物(anthracycllne，ANTH)是白血病化疗的基本药物[1]。DNR被称为“拓扑异构酶毒物”可与拓扑异构酶Ⅱ上的酪氨酸残基共价结合形成稳定的中间体，从而影响DNA组装、解螺旋、复制和转录，起抗肿瘤作用。但DNR具有强烈的心脏毒性，特别是对儿童心脏毒性，发生率高达65%，且无安全剂量阈值，表现为心律失常、充血性心力衰竭和(或)心肌病等，且多为不可逆性损伤，限制了其临床应用。阿魏酸钠(sodium ferulate, SF)是中药当归、川穹有效成份阿魏酸的钠盐，常用于血管性疾病辅助治疗，使用安全。课题组前期研究发现，SF可通过抑制心肌细胞氧化应激从而抑制心肌细胞凋亡保护DNR损伤的心肌细胞[2]。本研究以幼龄大鼠为研究对象，建立DNR致未成熟心肌损伤模型[3]，模拟DNR对儿童心脏的损伤,同时给予SF干预，着重从模型动物心力储备状态评价SF干预对DNR致未成熟心肌损伤影响，从心肌收缩舒张相关蛋白心肌特异性肌钙蛋白I(cardiac Troponin I ,cTNI)表达改变，探讨SF保护DNR致幼大鼠心脏损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

(24±3)日龄SD大鼠40只，体重60～80 g(上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005)；RM6240C型多道生理信号采集处理系统, YPJ01H型压力换能器(成都仪器厂)；PE50聚乙烯导管(Becton Dickinson 公司)；柔红霉素(Pfizer公司)；阿魏酸钠(闽东力捷迅药业有限公司)；异丙肾上腺素(Sigma公司)。

1.2 制备阿魏酸钠干预未成熟心肌柔红霉素损伤模型

大鼠适应性喂养7 d后，随机分为四组(n=10):对照组(Control)、柔红霉素组(DNR)、阿魏酸钠干预组(DNR+SF)和阿魏酸钠组(SF)。Control组和SF组，均腹腔注射0.9%NaCl(NS), 5 ml/kg，每周1次，共4次；DNR组和SF干预组，均腹腔注射DNR(0.5 mg/ml)，5 ml/kg，每周1次，共4次，制备未成熟心肌DNR损伤模型。其中Control组和DNR组，自第1次注射DNR开始， NS灌胃，5 ml/kg·d,连续25 d；SF组和DNR +SF组， 12 mg/ml SF灌胃，5 ml/kg·d,连续25 d,制备SF干预未成熟心肌模型。SF末次给药后第3天行各项检测。

1.3 检测幼龄大鼠左心室内压评价静息心功能

每组取6只大鼠，腹腔注射氨基甲酸乙酯( 1 g/kg) 麻醉、气管插管，通过右颈总动脉行左心室插管，通过压力换能器接RM6240C型多道生理信号采集处理系统，采样频率3 KHz，记录左心室内压10 min，测心率(heart rate,HR)、最大收缩速度(left ventrivular max systolic spead, LVP+dp/dtmax)、左心室舒张末期压(left ventrivular end diastolic pressure ,LVEDP)及最大舒张速度(left ventrivular max diastolic spead, LVP-dp/dtmax)等血流动力学指标评价大鼠静息心功能。

1.4 检测幼龄大鼠左心室内压对异丙肾上腺素反应评价心肌β肾上腺素受体功能

上述大鼠静息心功能检测后，经左颈外静脉插管注射生理盐水(1 ml/kg) 10 min后，注射等体积异丙肾上腺素(25 ng/kg)观察10 min，实验过程实时监测记录左心室内压波，量化分析异丙肾上腺素对血流动力学各指标影响，评价心肌β肾上腺素受体功能。

1.5 幼龄大鼠心肌细胞超微结构观察

每组取3只大鼠处死取心脏，置4℃ PBS中冲洗残血，取心尖部组织切成1 mm大小的组织块浸于戊二醛溶液中固定，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机制50～70 nm超薄切片，透射电子显微镜观察心肌组织超微结构并拍照。

1.6 Western blot检测心肌组织cTNI蛋白表达水平

取50 mg心室肌组织常规提取心室肌组织蛋白，用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。蛋白样品SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，加兔抗cTNI多克隆抗体(1∶800)4℃过夜，TBST洗膜3×10 min，HRP标记羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3×10 min，化学发光，显影定影。以GAPDH为内参照，用图像处理软件Phoretix 1D分析目标条带的灰度值。

1.7 RT-PCR检测心肌细胞cTNI mRNA 表达水平

上海生工生物科技有限公司设计并合成cTNI基因的引物，以GAPDH基因作为内参照(表1)。取50 mg心室肌组织,Trizol法提取总RNA, 用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit 逆转录合成cDNA，取1 μl cDNA进行PCR反应, 反应条件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，28个循环； 循环后均72℃终延伸7 min，4℃保存。 PCR产物用2%琼脂凝胶电泳分析。电泳后在紫外灯下拍摄照片, 用图像处理软件Phoretix 1D分析目标条带的灰度值。

Tab. 1 Sequence of primers and length of PCR products

GenePrimers(5'-3')Size(bp)GAPDHF:5'-ACAGCAACAGGGTGGT-GGAC-3'R:5'-TTTGAGGGTG-CAGCGAACTT-3'252cTNIF:5'-CACCAGGGACACCCT-TCTAA-3'R:5'-ACTTGCCACGCAGGT-CATAG-3'485

1.8 统计分析

2 结果

2.1 SF干预对DNR损伤幼龄大鼠心功能影响

与Control组相比，DNR组大鼠静息状态下心率下降(P<0.05)，各组间LVDEP、+dp/dtmax、-dp/dtmax无明显差别(表2)。与Control组相比，DNR组大鼠心脏对异丙肾上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量减少(P<0.05)，心肌收缩和舒张潜能下降，心功能下降； SF干预组大鼠心脏对异丙肾上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量较DNR组高(P<0.05)，SF干预逆转DNR造成的幼大鼠心肌收缩和舒张潜能下降,提高心功能。SF单用组大鼠心脏对异丙肾上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量无明显差别，SF单用对心功能无影响(表3)。

GroupLVEDP(mmHg)HR(b/min)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)Control-2.38±4.58413±5220106±3651-10196±1056DNR0.15±2.42305±38*17675±3576-9043±1359DNR+SF0.12±1.44301±3618441±2609-9692±826SF-2.97±1.52352±6421055±3182-10430±1469

LVEDP：Left ventrivular end diastolic pressure; HR：Heart rate; +dp/dtmax：Left ventrivular max systolic spead; -dp/dtmax： Left ventrivular max diastolic spead； DNR: Daunorubicin； SF: Sodium ferulate

*P<0.05vscontrol

GroupLVEDPHR+dp/dtmax-dp/dtmaxControl0.49±0.060.24±0.130.28±0.130.38±0.21DNR0.03±0.26*0.01±0.08*-0.01±0.06*-0.10±0.09*DNR+SF0.29±0.30#0.08±0.06#0.06±0.12#0.08±0.16#SF0.45±0.120.25±0.010.27±0.040.41±0.15

LVEDP： Left ventrivular end diastolic pressure； HR： Heart rate； +dp/dtmax： Left ventrivular max systolic spead； -dp/dtmax：Left ventrivular max diastolic spead； DNR: Daunorubicin； SF: Sodium ferulate

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsDNR

2.2 SF干预对DNR损伤幼龄大鼠心肌细胞超微结构影响

透射电子显微镜下, DNR组心肌细胞超微结构可见胞质疏松，肌节排列紊乱，Z线模糊，肌纤维溶解、断裂，线粒体固缩(图1B)，同魏征人等[4]研究蒽环类药物阿霉素对大鼠心肌超微结构影响结果一致。SF干预组心肌细胞超微结构较DNR组改善，胞质较浓密，各种细胞器较清晰,肌纤维排列整齐，肌小节较清晰，Z线可见,线粒体丰富(图1C)。Control组和SF单用组大鼠心肌细胞超微结构正常，胞质浓密，各种细胞器清晰可见,肌节排列整齐，Z线清晰，肌小节清晰可见，肌丝明显(图1A、D)。

Fig.. 1 Electronograph of myocardium(×10 k) A: Control group; B: DNR group; C: DNR+SF group; D: SF group; DNR: Daunorubicin; SF: Sodium ferulate

2.3 SF干预对DNR损伤幼龄大鼠心肌组织cTNI蛋白表达影响

与Control组相比，DNR组大鼠心肌组织cTNI蛋白表达明显下降(P<0.05)；SF干预组大鼠心肌组织cTNI蛋白表达下降但较DNR组高(P<0.05)；SF单用组大鼠心肌组织cTNI蛋白表达无明显改变(图2)。

2.4 SF干预对DNR损伤幼龄大鼠心肌组织cTNI mRNA表达影响

与Control组相比，DNR组大鼠心肌组织cTNI基因表达明显下降(P<0.05)；SF干预组大鼠心肌组织cTNI基因表达下降但较DNR组高(P<0.05)；SF单用组大鼠心肌组织cTNI基因表达无明显改变(图3 )。

3 讨论

白血病是儿童常见癌症，而DNR是白血病最常用的化疗药之一，但DNR存在明显的心脏毒性，表现为急性心脏损伤和慢性心脏损伤。DNR致心脏慢性损伤是DNR的严重副作用，特别对儿童有较大危险性，因此癌症患儿使用DNR化疗中心脏毒性问题倍受临床关注[5]。β肾上腺素信号系统异常是人和动物心肌病的特点之一，是缺血、非缺血性心肌病和慢性心功能不全的共同表现[6]。肌钙蛋白是肌肉收缩调节蛋白，由肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌钙蛋白C 三个不同亚基组成。心肌肌钙蛋白I(cTNI)仅存于心房肌和心室肌中，具有高度的心肌特异性，对心肌损伤程度具有高度敏感性。现有研究认为，心脏对异丙肾上腺素的收缩舒张反应与收缩蛋白cTNI量和对钙的亲和力变化有关[7]。本研究通过异丙肾上腺素激发试验(isoprenaline provocation test,IPT)，结果发现DNR损伤的心肌表现为β肾上腺素受体去敏化心力储备下降与前期研究结果一致[3]，同时发现DNR损伤幼龄大鼠心肌cTNI表达也下降，提示心肌cTNI表达量与心功能相关。

SF是中药当归、川穹有效成份阿魏酸的钠盐，具有明确的心脏保护作用。研究发现SF中的苯烯结构可以拮抗内皮素的生物活性，对心肌缺血/再灌注损伤有保护作用；通过调节前列环素(PGI2)和血栓素(A2)干预抑制血小板凝集和3H-SHT从血小板中释放改善心脏功能；通过对抗自由基、抗脂质过氧化、减轻心脏氧化应激损伤[8]。课题组前期研究发现，SF能通过清除活性氧，降低过氧化损伤，抑制心肌细胞线粒体途径凋亡减轻DNR的心肌毒性[2]。心肌氧化应激损伤时可激活细胞中MAP激酶，通过 p38MAPK-iPLA2-cTNI途径影响心肌β肾上腺素受体敏感性影响心功能[9]。

本研究在前期研究基础上[2, 3, 10],建立DNR致幼大鼠心肌损伤模型，模拟DNR对儿童心脏的损伤，同时给予SF灌胃干预，运用异丙肾上腺素实验从模型动物心力储备状态评价SF干预对DNR致未成熟心肌损伤影响，心肌超微结构观察和心肌cTNI表达改变探讨SF对DNR损伤心肌保护机制。研究结果显示，SF干预DNR损伤的心肌，逆转DNR损伤引起的心力储备下降；抑制肌纤维降解；反向调节DNR所致幼龄大鼠心肌细胞cTNI基因和蛋白质表达下降。

综上，结合课题组前期的研究结果[2]，本研究表明，SF干预DNR损伤的幼龄大鼠心肌，减轻DNR损伤的幼大鼠心肌的氧化应激可能通过调控心肌细胞的p38MAPK-iPLA2-cTNI信号通路，反向调节cTNI基因和蛋白质表达,改善心功能，保护DNR损伤幼大鼠心肌。然而目前，SF减轻DNR损伤心肌氧化应激和调控心肌cTNI基因和蛋白质表达的具体机制，仍尚未完全明确，有待于进一步研究。

[1] Weiss RB. The anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin[J].SeminOncol, 992, 19(6): 670-686.

[2] Wu ZJ, Yu J, Fang QJ,etal. Sodium ferulate protects against daunorubicin-induced cardiotoxicity by inhibition of mitochondrial apoptosis in juvenile rats[J].JCardiovascPharmacol, 2014, 63(4): 360-368.

[3] 方秋娟， 连加辨， 吴枝娟， 等. 柔红霉素致幼大鼠慢性心力衰竭模型建立与评价[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, 29(02): 113-115.

[4] 魏征人， 陈智嘉， 张春璐， 等. 黄芪注射液对阿霉素所致心肌病理改变和超微结构的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2013, 29(05): 404-405.

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[10]Fang Q, Kan H, Lewis W,etal. Dilated cardiomyopathy in transgenic mice expressing HIV Tat[J].CardiovascToxicol, 2009, 9(1): 39-45.

Sodium ferulate protects against daunorubicin-induced cardiotoxicity in juvenile rats

LIAN Jia-bian1, 2, WU Zhi-juan2, FANG Qiu-juan2△, YU Jing2, HE Rui-lan2

(1. Department of Base Clinical, Sanming Vocational Technical College, Sanming 365000；2. Department of Physiology and Pathophysiology, Base Clinical College, Fujiang Medical University, Fuzhou 350004, China)

Objective: To investigate the protect effects of sodium ferulate (SF) on the daunorubicin(DNR)-induced cardiotoxicity in juvenile rats. Methods: Forty male juvenile SD rats were randomly divided into control group (Control), daunorubicin group (DNR), sodium ferudate treatment group (DNR+SF), sodium ferudate group (SF)(n=10). Juvenile rats were intraperitoneally treated with DNR (2.5 mg/kg every week for a cumulative dose of 10 mg/kg) preparation immature myocardial injury model in presence with SF (60 mg/kg) oral treatment for 25 days. The left ventricular pressure and its response to isoproterenol were measured using left ventricular catheter. Rat myocardium myocardial pathology specimens and ultrastructure changes were also observed. The expression of cardiac Troponin I (cTNI) was detected by Western blot and RT-PCR. Results: SF treatment could inhibit the decreasing of heart rates induced by DNR damage (P<0.05); it could increase the left ventrivular end diastolic pressure(LVEDP), heart rate, the maximal left ventrivular systolic speed(LVP+dp/dtmax) and the maximal left ventrivular diastolic speed (LVP-dp/dtmax) responding to isoproterenol stimulation(P<0.01); SF also could improve the myocardial ultrastructure injuries and inhibit the decreasing of cTNI expression caused by DNR damages (P<0.05). Conclusion: SF treatment could alleviate the decreasing of cardiac reservation induced by DNR damages in juvenile rats, which might be related to its reversing the effects on the cardiac systolic and diastolic function injuries and its inhibiting effects on the decreasing of cTNI expression caused by DNR. The mechanism of SF preventing daunorubicin-induced cardiotoxicity in juvenile rats is relevant to inhabited cardiac Troponin I expression.

sodium ferulate； daunorubicin； myocardial protection; isoproterenol

福建省自然科学基金(2011J05069)；福建医科大学博士启动基金(2010bs007)；福建省教育厅中青年教师教育科研项目(JA14442)

2014-06-23 【修回日期】2014-10-14

R322.1

A

1000-6834(2015)01-054-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.016

△【通讯作者】Tel： 18906087901； E-mail： 514096301@qq.com