吗啡诱导条件性位置偏爱大鼠伏隔核壳区遥测电活动分析*

虞 冉， 叶 政， 李 晶， 李 敏， 白 羽， 潘群皖△

(1. 皖南医学院生理教研室， 2. 计算机教研室， 安徽芜湖 241000)



吗啡诱导条件性位置偏爱大鼠伏隔核壳区遥测电活动分析*

虞 冉1， 叶 政1， 李 晶1， 李 敏1， 白 羽2， 潘群皖1△

(1. 皖南医学院生理教研室， 2. 计算机教研室， 安徽芜湖 241000)

目的：记录吗啡诱导条件性位置偏爱(CPP)大鼠伏隔核(NAc)壳区电活动变化，分析其与觅药行为之间的关系。方法：SD大鼠40只，于NAc壳区脑立体定位电极埋藏后，随机分为手术对照组和吗啡诱导CPP组(n=20)，后者制作吗啡依赖模型。利用CPP视频系统结合脑电无线遥测技术，记录各组大鼠在黑、白箱停留、黑-白箱穿梭和白-黑箱穿梭时大鼠NAc壳区电活动变化，分析其各频段百分比的差异。结果：与手术对照组比较，吗啡诱导CPP组大鼠黑箱停留时，左右侧NAc壳区电活动0～10 Hz频段百分比减少(P<0.05)，10～20 Hz与30～40 Hz频段百分比增加(P<0.05 ，P<0.01)；白箱停留时，0～10 Hz与30～40 Hz频段百分比减少(P<0.05 ,P<0.01)，10～20 Hz增加(P<0.05 ,P<0.01)；黑-白箱穿梭时，0～10 Hz频段百分比增加(P<0.05，P<0.01)，10～30 Hz减少(P<0.05)；白-黑箱穿梭时，0～10 Hz频段百分比减少(P<0.05)，10～30 Hz增加(P<0.05)，进一步将吗啡诱导CPP组大鼠穿梭时NAc壳区电活动与停留状态下相比较，白箱与白-黑箱穿梭比较其脑电无明显差异，但相对于黑箱停留，黑-白箱穿梭时左右NAc壳区电活动0～10 Hz与40～50 Hz频段百分比增加(P<0.05)，10～20 Hz和30～40 Hz频段百分比减小(P<0.05)。结论：吗啡诱导CPP大鼠黑-白箱穿梭觅药时，NAc壳区电活动发生特异性改变，这种改变可能与觅药行为的动机发生相关。

吗啡；条件性位置偏爱；伏隔核壳区；无线遥测；电活动；大鼠

中脑-边缘多巴胺投射系统是形成中枢奖赏效应和药物依赖奖赏环路的重要结构基础[1]，其中伏隔核(nucleus accumbens，NAc)是该系统中至关重要的神经核团之一，它由外部的壳区(shell)以及内侧的核部(core)构成。其中伏隔核壳区(NAcs shell)主要接受中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)、内侧前额皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)、杏仁核、海马等的神经纤维联系，同时发出神经投射至苍白球、视交叉前区、VTA、下丘脑、黑质致密部、脑桥中间网状结构和导水管周围灰质等，与药物依赖奖赏环路的关系较核部更加密切，同时也在药物依赖的形成、消退(extinction)和复燃(reinstatement)行为产生过程中，发挥了较为重要的作用。

研究表明，阿片类药物可正性强化VTA至NAc的多巴胺能神经元，使NAc壳区细胞外多巴胺释放增加，导致大鼠自给药行为增强。而选择性损伤NAc壳区或局部注射多巴胺受体拮抗剂SCH23390，均可明显抑制吗啡诱导大鼠的觅药行为[2]。另外，阿片类药物导致的这种NAc壳区的多巴胺释放增加会继发性地导致伏隔核内中型多棘神经元(medial spiny neurons，MSNs)发生相应的适应性改变，比如神经元膜电位或自发放电的改变[3]。Sara Karimi等发现使用100 μA电流对NAc壳区进行局部电刺激后可以明显抑制吗啡诱导大鼠对于伴药箱位置的偏爱[4]。本室以往的研究发现，吗啡诱导CPP大鼠伴药箱觅药过程中，其内侧前额皮层缘前区(prelimbic area，PrL)遥测脑电β波频段显著增加，δ波频段显著减少[5]。鉴于NAc壳区与PrL区具有神经环路联系以及在阿片类药物依赖形成中的协同作用，本研究拟使用无线遥测脑电技术，通过视频观察，实时记录吗啡诱导条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)大鼠伴药箱觅药行为状态下NAc壳区电活动变化，以期寻找与药物依赖形成及觅药行为发生有关的特征性电活动改变。

1 材料与方法

1.1 主要药物和仪器

盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药，批号：110508-2)。BW-200型生理无线遥测系统(成都泰盟科技有限公司生产),CM1900型冰冻切片机(德国徕卡公司生产)。JLBehv-CPP位置偏爱视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司生产)。

其中，CPP视频系统由左右黑白两个视频监控箱构成，中间有一通道可供大鼠自由穿梭。两箱体底部分别为横条状(白箱)及网格状(黑箱)铁制底板。可以从视觉及触觉两方面增强大鼠对于箱体的条件性依赖。

1.2 动物

SPF级SD大鼠40只，由常州市文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2011-0003，雌雄不限，体重300～375 g，常规饲养，自由进水进食。实验筛选过程中，40只大鼠均为天然黑箱偏爱，未发现有天然白箱偏爱大鼠。

1.3 NAc壳区电极埋藏

1%戊巴比妥钠(5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，使用脑立体定位仪行NAc壳区电极埋藏手术。NAc壳区定位参照脑立体定位图谱[6]：前囟1.7 mm，矢状缝旁开0.8 mm，定位靶点后，实施颅骨打孔术，将0.3 mm漆包镍铬丝制成的记录电极插入硬膜下7.5 mm。电极埋藏后，连同置于皮下的参考电极一起使用牙科水泥固定并封闭切口。手术后皮下注射青霉素(400 kU/kg)，持续3 d，预防感染。全部实验结束后，对电极埋藏大鼠断头取脑，并作快速冷冻NAc切片及HE染色，以确定壳区定位准确。

1.4 建立吗啡诱导CPP大鼠模型和分组

模型建立分为三个阶段。第一阶段为前测阶段，将NAc壳区电极埋藏大鼠饲养7 d后，放入CPP视频箱内习服3 d，任其在黑、白箱中自由停留和穿梭，每天1次，每次45 min。第4天通过CPP视频系统白箱停留时间及其百分比分析(白箱停留时间/900 s×100%，根据我们之前的相关研究[5]发现，900 s可以很好地表现出大鼠对于箱体的偏爱程度)数据，检测其天然位置偏爱。作为夜行性动物，大鼠本能对黑箱有着天然偏爱，故选择天然黑箱偏爱大鼠，并将其随机分为吗啡诱导CPP组和手术对照组(n=20)。第二阶段进行吗啡诱导训练。封闭视频箱通道，并将非天然偏爱箱(白箱)设为伴药箱。吗啡诱导CPP组每天上午给予皮下注射吗啡一次(吗啡剂量：d1:10 mg/kg；d2:20 mg/kg；d3:30 mg/kg；d4:40 mg/kg；d5:50 mg/kg；d6:60 mg/kg；d7:60 mg/kg)，注射后将大鼠置于白箱1 h，当天下午给予皮下注射相同剂量生理盐水，注射后将大鼠置于黑箱1 h。手术对照组大鼠同法给予皮下注射等量生理盐水。连续7 d。第三阶段为评价阶段，诱导训练结束后第24～72小时，任两组大鼠在视频箱中自由穿梭，记录15 min白箱停留时间及其时间百分比，做组间比较，同时，对吗啡诱导组大鼠注射药物前(第一阶段前测值)、后(评价阶段测值)做配对t检测，以吗啡诱导前后伴药箱停留时间自身对照和组间检验显著延长，确定大鼠产生了CPP。

1.5 对大鼠NAc壳区电活动进行无线遥测及分析

使用绑带将无线遥测发射子固定在大鼠背部，在CPP视频系统的黑、白箱内，通过脑电无线遥测系统实时记录各组大鼠黑箱停留、白箱停留、黑-白箱穿梭、白-黑箱穿梭行为状态下，左右侧NAc壳区放电活动，并通过系统软件对记录到的原始脑电采用快速傅里叶频谱分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 吗啡诱导大鼠CPP测试结果

建模前吗啡诱导CPP组与手术对照组大鼠白箱停留时间之间无显著性差异。评价阶段吗啡诱导CPP组大鼠白箱停留时间较建模前明显延长(P<0.01)，与同阶段手术对照组大鼠相比白箱停留时间及其停留时间百分比亦明显延长(P<0.01)。表明吗啡诱导CPP组大鼠对伴药箱产生了明显的位置偏爱，即大鼠对吗啡产生依赖(表1)。

GroupWhiteboxstayingtime(s)Percentage(%)Operation-onlycon-trol157.00±102.1017.47±11.34Morphine-inducedCPP— — Before-injection122.00±99.3613.59±11.04Druginjectionendd1378.81±70.11**##41.60±8.15**##d2556.34±156.68**##60.72±18.52**##

CPP： Conditioned place preference

**P<0.01vsoperation-only control group；##P<0.01vsbefore-injection

2.2 NAc壳区不同行为状态下的电活动记录

2.2.1 黑、白箱停留时两组大鼠遥测脑电比较 图1显示两组大鼠停留在黑、白箱时的电活动变化。与手术对照组比较，吗啡诱导CPP组大鼠在黑箱停留时(图1A)，其左、右侧NAc壳区0～10 Hz频段电活动百分比减小(P<0.05)，10～20 Hz频段和30～40 Hz频段百分比增加(P<0.05，P<0.01)。在白箱停留时(图1B)，吗啡诱导CPP组大鼠左、右侧NAc壳区同样表现为0～10 Hz频段电活动百分比减小(P<0.05)，10～20 Hz频段百分比增加(P<0.05,P<0.01)，但30～40 Hz频段百分比减小(P<0.05，P<0.01)。

2.2.2 两箱穿梭潜伏期两组大鼠遥测脑电比较 图2显示吗啡诱导CPP组5号大鼠黑-白箱和白-黑穿梭时，左侧NAc壳区原始遥测电活动曲线。大鼠在穿梭运动过程中，由于肌电活动的影响，所记脑电曲线幅值增大。为了便于电信号的比较，本实验统一采样分析穿梭运动起始点向前约2.5 s的电活动信号(图 2中箭头所指段)，该段电活动信号相当于穿梭运动的潜伏期，蕴含着穿梭动机的脑电编码信息。

Fig. 2 Electrical activity on left NAc shell when 5 rat of morphine-induced CPP group shuttled between black-white chamber(A)and white-black chamber(B) NAC: Nucleus accumbens

与手术对照组比较，吗啡诱导CPP组大鼠黑-白箱穿梭时(图3A)，其左、右侧NAc壳区电活动呈现0～10 Hz频段百分比增加(P<0.05，P<0.01)，10～30 Hz频段百分比减小(P<0.05)；而在白-黑箱穿梭时(图3B)，吗啡诱导CPP组大鼠左、右侧NAc壳区0～10 Hz频段百分比减小(P<0.05)，10～30 Hz波段增加(P<0.05)。

2.2.3 吗啡诱导CPP组大鼠黑、白箱停留与穿梭状态的电活动比较 根据统计分析，吗啡诱导CPP大鼠白-黑箱穿梭时，其左、右侧NAc壳区电活动频带百分比，与白箱停留状态下无显著性差异(P>0.05，图4A)，但黑-白箱穿梭时，左右侧NAc壳区0～10 Hz和40～50 Hz频段百分比增加(P<0.05)，10～20 Hz频段和30～40 Hz频段百分比减小(P<0.05，图4B)。

3 讨论

大量研究表明，阿片类药物可直接激活VTA区投射至NAc壳区的多巴胺(dopamine, DA)神经元，同时也可通过激活VTA内的μ受体，解除GABA中间神经元对DA能神经元的抑制，从而增加NAc区DA释放，使壳区细胞外DA浓度增加，引发大鼠海洛因自给药增强反应，NAc壳区返回至VTA的GABA能神经元兴奋，可抑制这种由DA释放导致的药物奖赏效应。阿片类药物通过中枢奖赏环路影响NAc的机能状态，进而引发由精神性依赖而产生的觅药行为[7，8]，这种机能状态的改变和精神性依赖的形成，均会以NAc神经细胞电活动的形式表达出来。朱再满等对于海洛因诱导CPP大鼠给药前、后及戒断期三个阶段NAc神经元电活动的研究发现，与给药前相比,给药后即刻和戒断期NAc神经元电活动平均波幅均显著增大(P<0.01),但戒断期的平均波幅比给药后即刻期的明显降低(P<0.01)，提示NAc神经元参与了脑部对于药物依赖的调节活动[9]。本研究进一步以NAc壳区作为靶点，利用无限遥测技术，实时记录吗啡诱导CPP大鼠行为状态下，该区域的神经电活动变化，以期寻找出可能与觅药行为发生相关的特异性电活动改变。

与手术对照组相比较，吗啡诱导CPP组大鼠在黑、白箱停留时，左、右侧NAc壳区电活动变化均呈现0～10 Hz频段百分比减少，10～20 Hz频段百分比增加，这表明小剂量吗啡7 d注射戒断后，NAc壳区神经元活动趋于去同步化改变，参与兴奋的神经元数目增加。与此同时，也可观察到在黑箱停留时，30～40 Hz频段百分比增加，而在白箱停留时却呈现相反的改变，即30～40 Hz频段百分比减小，这种电活动的差异，可能与大鼠伴药箱环境线索记忆以及白箱光线刺激有关。

本实验将大鼠非嗜好箱白箱作为伴药箱，因此，吗啡诱导CPP大鼠黑-白箱穿梭，可视为发动觅药行为。在大鼠两箱穿梭脑电数据分析中，我们统一截取大鼠发生穿梭运动潜伏期约2.5 s的电活动信号，这部分信号数据蕴含大鼠穿梭动机形成和即将发动觅药行为的电活动编码。实验中我们发现：与手术对照组大鼠比较，吗啡诱导CPP组大鼠在黑-白箱穿梭时，左右侧NAc壳区电活动0～10 Hz频段百分比增加，10～30 Hz频段百分比减少；而在白-黑箱穿梭时，这种电活动却表现完全相反的变化。这些提示吗啡诱导CPP大鼠将天然嗜好箱(黑箱)和伴药箱(白箱)作为穿梭目标时，其NAc壳区神经元所编码的电活动不尽相同。当大鼠欲发动黑-白箱穿梭，将伴药箱作为其穿梭目标时，NAc壳区神经元活动趋于同步化，而当大鼠向天然嗜好黑箱穿梭时，NAc壳区神经元活动则趋于去同步化。

通过上述比较分析，已知吗啡诱导CPP组大鼠黑、白箱停留状态和穿梭状态下，NAc壳区电活动均与手术对照组具有明显的差异，这种差异与大鼠觅药活动存在着何种关系？为此，我们将吗啡诱导CPP大鼠停留状态和穿梭状态下NAc壳区电活动进行了比较。结果显示，与白箱停留状态比较，吗啡诱导CPP组大鼠白-黑箱穿梭时NAc壳区电活动无明显差异，但与黑箱停留状态比较，大鼠黑-白箱穿梭时，左右侧NAc壳区电活动显示0～10 Hz和40～50 Hz频段百分比增加，10～20 Hz频段和30～40 Hz频段百分比减小，提示通过吗啡诱导7 d戒断后，虽然大鼠在不同的行为状态下，均表现出对吗啡的精神性依赖，但黑-白箱穿梭时所表现的特异性电活动改变，与其停留在黑箱或手术对照组黑-白箱穿梭时电活动均不相同，这种特异性电活动的改变可能与伴药箱觅药活动有关。

进一步分析可知，脑部0～10 Hz频段电活动主要相当于皮层脑电中的δ和θ振荡，10～20 Hz频段则主要相当于α和μ(即低频β波)振荡，30～100 Hz频段则相当于γ振荡，以10 Hz为一组，可将γ振荡分为γ1～7。本实验中吗啡诱导CPP组大鼠黑-白箱穿梭时，NAc壳区0～10 Hz和40～50 Hz频段百分比增加，10～20 Hz频段和30～40 Hz频段百分比减小，说明其穿梭潜伏期脑电编码中出现了δ～θ和γ2振荡增强，α～μ和γ1振荡减弱的改变。最新相关研究发现，在慢性吗啡依赖大鼠戒断后1～2 d，NAc电活动在体记录研究发现，0～15 Hz频段振荡功率急剧增加，出现δ及θ振荡，同时，伴有低频及高频的γ振荡加强[10]，这与本实验所获结果基本吻合。很多文献报道，多巴胺神经元的放电节律处于0～10 Hz的范围区间，考虑到NAc壳区是脑内DA受体密度最高的脑区之一，由于受到吗啡诱导的作用，该区DA能神经元活动将趋于活跃，从而可引发由正性强化作用所引起的觅药行为。此外，Igarashi等发现，大鼠在执行奖赏运动行为的开始阶段，大脑运动皮层的θ振荡功率的幅度减小了20%左右(可视为θ振荡频率有所增加)，低频γ振荡功率呈现减少趋势，并在奖赏运动发生400 ms后出现宽峰，提示与行为活动的发动或对奖赏回报的预期有关[11]。

综上所述，本实验采用无线遥测技术，通过视频检测方法，对吗啡依赖CPP大鼠不同行为状态下NAc壳区电活动进行了实时记录，通过比较分析发现，吗啡诱导CPP大鼠黑-白箱穿梭觅药潜伏期，左右侧NAc壳区电活动呈现δ～θ和γ2振荡增强，α～μ和γ1振荡减弱的编码改变，这种改变与大鼠CPP觅药行为的动机形成和即将发动的觅药行为有密切关系。

[1] Ikemoto S. Brain reward circuitry beyond the mesolimbic dopamine system: a neurobiological theory[J].NeurosciBioheavRev， 2010， 35(2): 129-150.

[2] Gao J, Li Y, Zhu N,etal. Roles of dopaminergic innervation of nucleus accumbens shell and dorsolateral caudate-putamen in cue-induced morphine seeking after prolonged abstinence and the underlying D1- and D2-like receptor mechanisms in rats[J].JPsychopharmacol， 2013， 27(2): 181-191.

[3] Wu X, Shi M, Ling H,etal. Effects of morphine withdrawal on the membrane properties of medium spiny neurons in the nucleus accumbens shell[J].BrainResBull， 2013， 90(1): 92-99.

[4] Karimi S, Radahmadi M, Fazilati M,etal. Roles of the nucleus accumbens (shell) in the acquisition and expression of morphine-induced conditioned behavior in freely moving rats[J].InJPreMed， 2014， 5(3): 262-268.

[5] 李 晶， 潘群皖， 白家明， 等. 吗啡急性戒断大鼠边缘前皮层无线遥测脑电活动的研究[J]. 中国药理学通报， 2014， 30(1)： 122-125.

[6] George P, Charles W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordrnates，Sixth Edition[M].Amsterdam,AcademicPressofElsevier, 2007: 18-19.

[7] Baik JH. Dopamine signaling in reward-related behaviors[J].FrontNeuralCircuits， 2013， 7: 152

[8] Mameli M, Lüscher C. Synaptic plasticity and addiction: learning mechanisms gone awry[J].Neurophamacol， 2011， 61(7): 1052-1059.

[9] 朱再满， 华田苗， 周鸿铭， 等. 海洛因诱导CPP大鼠伏隔核脑电活动的无线遥测研究[J]. 中国应用生理学杂志， 2014, 30(4)： 368-372.

[10]Dejean C, Boraud T, Le Moine C. Opiate dependence induces network state shifts in the limbic system[J].NeurobiolDis, 2013, 59: 220-229.

[11]Igarashi J, Isomura Y, Arai K,etal. A θ-γ oscillation Code for Neuronal Coordination during Motor Behavior[J].JNeurosci, 2013, 33(47): 18515-18530.

Wireless telemetry electrical activity of nucleus accumbens shell in morphine-induced CPP rats

YU Ran1， YE Zheng1， LI Jing1， LI Min1， BAI Yu2， PAN Qun-wan1△

(1. Department of Physiology， 2. Department of Computer ，Wannan Medical College， Wuhu 241000， China)

Objective: To analyse the relationship between the electrical activity changes of nucleus accumbens (NAc) shell and the drug-seeking behavior by recording NAc shell electrical activity in conditioned place preference (CPP) rats induced by morphine. Methods: Forty SD rats were randomly divided into operation-only control group and the morphine-induced CPP group after stereotaxic electrode was buried on rats NAc shell and the latter group was used to establish the morphine CPP model(n=20). A CPP video system combining with the technique of electrical activity wireless telemetry was used in the study. The NAc electrical activity from each group of rats was recorded by wireless telemetry respectively, which included staying in black or white chamber of video box, shuttling between black-white chambers and between white-black chambers. The electrical activity differences were analyzed by the percentage of each wave. Results: When the morphine-induced rats staying in black chamber, compared with the operation-only control group, the NAc shell electrical activity showed that the percentage of 0～10 Hz was increased(P<0.05), meanwhile, those of 10～20 Hz and 30～40 Hz were reduced(P<0.05,P<0.01); when the morphine-induced rats staying in white chamber, the NAc shell electrical activity showed that the percentage of 0～10 Hz and 30～40 Hz were increased(P<0.05 ,P<0.01), that of 10～20 Hz was reduced(P<0.05 ,P<0.01); when the morphine-induced rats in black-white shuttling status, the NAc shell electrical activity showed that the percentage of 0～10 Hz was increased(P<0.05，P<0.01), that of 10～30 Hz was reduced(P<0.05); and in the white-black shuttling status, the electrical activity showed that the percentage of 0～10 Hz was reduced(P<0.05), that of 10～30 Hz was increased(P<0.05); the electrical activity was further compared between staying status and shuttling status in the morphine-induced CPP group. There was no significant difference of electrical activity between the rats in white-black shuttling status and staying in white chamber. However, when rats in black-white shuttling status, compared with staying in black chamber, the electrical activity showed that the percentage of 0～10 Hz and 40～50 Hz were increased(P<0.05), meanwhile, those of 10～20 Hz and 30～40 Hz were reduced(P<0.05). Conclusion: The electrical activity changes of NAc shell in morphine-induced CPP rats were different from those of the operation-only control group, and these changes might be associated to the rat’s drug-seeking behavior.

morphine; conditioned place preference; nucleus accumbens shell region; wireless telemetry; electrical activity； rats

安徽省自然科学基金资助(090413096)

2014-06-04 【修回日期】2014-10-20

R338.2

A

1000-6834(2015)01-049-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.015

△【通讯作者】Tel： 0553-3932473； E-mail： panqunw@163.com