钙敏感受体对大鼠糖尿病性心肌病的影响*

贾 振， 孙 建， 李鸿珠， 李宏霞， 彭 雪， 邵洪江， 杨金霞， 徐长庆， 白淑芝△

(1. 黑龙江中医药大学附属第一临床医院周围血管病科， 哈尔滨 150040； 2. 牡丹江医学院机能学教研室, 黑龙江 牡丹江 157011；3. 哈尔滨医科大学基础医学院病理生理学教研室， 黑龙江 哈尔滨 150086)



钙敏感受体对大鼠糖尿病性心肌病的影响*

贾 振1， 孙 建2， 李鸿珠3， 李宏霞3， 彭 雪3， 邵洪江3， 杨金霞3， 徐长庆3， 白淑芝3△

(1. 黑龙江中医药大学附属第一临床医院周围血管病科， 哈尔滨 150040； 2. 牡丹江医学院机能学教研室, 黑龙江 牡丹江 157011；3. 哈尔滨医科大学基础医学院病理生理学教研室， 黑龙江 哈尔滨 150086)

目的：观察钙敏感受体(CaSR)在大鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法：30只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、糖尿病4周组和糖尿病8周组(n=10)。高糖高脂饮食4周后腹腔注射STZ(30 mg/kg)建立糖尿病模型。通过透射电镜观察心肌超微结构的变化，通过Western blot检测心肌组织CaSR、肌浆网 Ca2+-ATPase (SERCA)和受磷蛋白(PLN)的蛋白表达。结果：与对照组相比，随着病程的延长糖尿病组大鼠心肌CaSR、SERCA蛋白表达降低，PLN表达增加，心肌结构损伤逐渐加重。结论：在大鼠糖尿病性心肌病进展过程中CaSR的表达逐渐降低，并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生。

钙敏感受体；糖尿病性心肌病；大鼠

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的严重合并症之一[1]，发病机制复杂，迄今尚未完全阐明。钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)属于G蛋白耦联受体，目前，关于CaSR的研究已经成为国际上的热点，国内则刚起步不久，对其研究主要集中在慢性肾衰[2]和甲状旁腺等疾病上，在心血管系统研究的较少[3]，有关CaSR在DCM发生发展中的作用更是鲜见报道。本实验旨在观察大鼠DCM不同时间点心肌组织CaSR蛋白表达的变化及心肌损伤的程度，拟进一步揭示DCM的发生机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材

蛋白定量试剂盒(北京碧云天)，CaSR抗体(Alpha Diagnostic International Inc., USA)；PLN、SERCA、GAPDH多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)；其他试剂为国产分析纯。主要器材包括BECKMAN 低温离心机，紫外凝胶检测和成像系统( Bio -Rad)，酶标仪( DG3022 A)，Western blot电泳槽(北京六一厂)等。

1.2 实验动物与分组

健康 Wistar 雄性大鼠180～250 g，由哈尔滨医科大学附属二院动物研究所提供。30只雄性大鼠，饲养在22℃～24℃、12 h∶12 h昼夜循环的安静环境中。适应1周后，动物随机分为3组：(1)正常对照组(Control)；(2)糖尿病4周组(Dia-4w)；(3)糖尿病8周组(Dia-8w)(n=10)。对照组大鼠给予正常的饮食饮水。糖尿病组大鼠喂养高糖高脂饮食(成分：20%糖，10%猪油，2%胆固醇，1%胆酸钠，67%基础饲料)。一个月后，大鼠禁食12 h，糖尿病组通过腹腔注射低剂量佐链脲菌素( STZ, 30 mg/kg，溶于0.1 mol/L枸橼酸钠溶液中)。对照组给予单独注射枸橼酸钠。三天后检测血糖高于16.7 mmol/L为造模成功。观察大鼠一般状态，每周监测血糖、饮食、饮水量，直至实验结束。

1.3 血糖、甘油三酯、胆固醇和胰岛素测定

实验结束前1 d，从下腔静脉采血离心，于4℃冰箱静置15 min，然后用低温离心机离心3 000 r/min×5 min后取上清。甘油三酯和胆固醇通过全自动生化检测仪检测。血清胰岛素通过商业化ELISA试剂盒(ADL，USA)检测，步骤完全按照试剂盒说明书操作。通过大鼠尾静脉采血用血糖仪(ACCU CHEK，Roche，Germany)检测血糖。

1.4 电镜观察超微结构

取心室肌组织，PBS 洗涤 1 遍，4℃，2.5% 戊二醛固定；1% 锇酸固定，常规乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅-铀双重染色，用H-7650型透射电镜观察并摄片。

1.5 Western blot 检测蛋白的表达

取各组大鼠心室肌组织，液氮研磨后加入组织裂解液，4℃ 裂解 1 h，提取蛋白。取 50 μg 总蛋白样品进行 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至 PVDF 膜，分别用 CaSR 抗体(1∶2 000)、PLN(1∶500)、SERCA(1∶1 000)、GAPDH(1∶500)抗体， 4℃ 震荡过夜。 再用二抗(1∶1 000 的羊抗兔 IgG 二抗；1∶1 000 的兔抗鼠 IgG 二抗，碱性磷酸酶标记)孵育1 h后显色，在凝胶成像系统下拍照、分析。计算各蛋白条带的光密度值，蛋白表达水平用其与内参 GAPDH 光密度比值来表示。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般状态

实验期间，正常对照组大鼠精神状态良好、反应敏捷、动作迅速、色光泽。糖尿病组大鼠全部出现了大量饮水，饮食增多，精神萎靡不振，反应迟钝，动作缓慢，毛色晦暗，视力下降(表1)。

GroupWaterintake(ml/day)Foodintake(g/day)Control28.0±2.112.5±1.1Dia-4w180.0±5.6*38.5±2.3*Dia-8w230.0±6.2*#45.0±2.9*#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

2.2 血糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇测定

与正常对照组大鼠相比，糖尿病组大鼠随机血糖显著升高(P<0.05)，血清胆固醇(cholesterol, Chol)、甘油三酯(triglyceride， TG)和胰岛素显著升高(P<0.05)，尤其糖尿病大鼠8周组血清胰岛素水平更高(P<0.05,表2)。

GroupGlucose(mmol/L)Chol(mmol/L)TG(mmol/L)Insulin(pmol/L)Control5.2±0.21.15±0.130.34±0.05268.70±12.01Dia-4w29.6±2.8*21.07±2.61*4.09±0.37*575.25±46.25*Dia-8w26.8±2.5*19.87±1.31*3.79±0.57*658.40±32.96*#

Chol: Cholesterol; TG: Triglyceride; Dia: Diabetic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

2.3 透射电镜下各组心肌组织超微结构的改变

正常对照组心肌细胞排列整齐，心肌细胞质膜连续、完整，肌丝排列整齐，线粒体丰富，大小均一、排列整齐。糖尿病组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞质膜模糊、断裂，线粒体肿胀，空泡样变，大小不一，排列紊乱，糖尿病8周组更为明显(图1)。

Fig. 1 Ultrastructure alteration of rat myocardium in different goups (×5 000)

2.4 心肌组织 CaSR、SERCA、PLN 蛋白表达的变化

与正常对照组相比，糖尿病组大鼠心肌组织CaSR表达量随病程延长逐渐降低(P<0.05,图2A)，同时SERCA表达逐渐减少，PLN表达升高，SERCA/PLN比值逐渐降低，说明钙泵的活性逐渐降低(图2B)。

Fig.. 2 Protein expression of CaSR(A), SERCA and PLN(B) in heart CaSR： Calcium-sensing receptor； SERCA： Ca2+-ATPase； PLN： Phospholamban; Dia: Diabetic*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

3 讨论

本实验通过复制大鼠DCM 动物模型，观察大鼠的一般状态及超微结构变化，并检测心肌组织CaSR及相关钙调控蛋白的表达来探讨CaSR在大鼠DCM发生中的作用。

本研究采用高糖高脂饮食联合小剂量STZ腹腔注射的方法来复制大鼠2型DCM 动物模型。与对照组相比，模型组大鼠出现与临床糖尿病患者类似的表现(多食和多饮)，血糖、甘油三酯、胆固醇显著升高，血清中胰岛素水平也明显升高，表明出现了胰岛素抵抗。上述结果，说明本实验成功建立了大鼠2型DCM 动物模型。

与正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌超微结构发生明显的改变，出现了线粒体肿胀、肌原纤维断裂和细胞核染色质的浓缩和边集化。心肌超微结构的损伤符合Cooper GJ[4]、林中民等[5]报道的DCM的特点。由此可见，我们成功地复制了2型糖尿病大鼠诱导的DCM模型。

DCM 的发生机制十分复杂，迄今尚不十分清楚。本文采用Western blot 方法检测了糖尿病大鼠4周和8周时心肌CaSR蛋白的表达，结果发现糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表达呈时间依赖性降低，这一变化和心肌超微结构损伤的程度密切相关。Ward等用STZ复制的大鼠糖尿病模型，2周后发现肾脏CaSR表达降低约50%。Weston 等发现，ZDF大鼠肠系膜动脉CaSR表达降低是引起糖尿病血管合并症的重要原因之一[6]。看来，糖尿病或肥胖症大鼠其他器官同我们观察到的心肌相同，CaSR的表达也是降低的。

目前认为，DCM与慢性心力衰竭一样，伴有Ca2+调控蛋白表达及活性异常，这是造成心肌舒缩功能异常的主要原因[7]。PLN和SERCA是心肌细胞 Ca2+调控的重要蛋白，在糖尿病状态下发生失调，必然引起心肌功能受损[8]。本研究发现，2型糖尿病大鼠4周和8周心肌组织 SERCA表达减少，PLN表达增强。SERCA活性降低可引起肌浆网摄取Ca2+能力下降，直接导致心肌细胞钙稳态紊乱从而造成心脏功能异常、引起心肌损伤。

综上，本研究发现2型糖尿病大鼠心肌组织CaSR表达呈时间依赖性降低，DCM大鼠心肌出现钙稳态紊乱，造成心肌的进一步损伤，这将为临床DCM的治疗提供新的理论基础。

[1] Huynh K, Bernardo BC, McMullen JR,etal. Diabetic cardiomyopathy: Mechanisms and new treatment strategies targeting antioxidant signaling pathways [J].PharmacolTher， 2014， 142(3)： 375-415.

[2] 陈国荣， 刘 毅， 毛孙忠， 等. 黄芪对糖尿病性肾病大鼠心肌脂质过氧化作用及一氧化氮水平的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2001， 17(2)： 186-188.

[3] 徐长庆， 张伟华. 心血管系统钙敏感受体的研究进展[J]. 中国病理生理杂志， 2010， 26(2)： 409-413.

[4] Cooper GJ, Phillips AR, Choong SY,etal. Regeneration of the heart in diabetes by selective copper chelation [J].Diabetes， 2004， 53(9)： 2501-2508.

[5] 林中民， 焦立卓， 郑 怡， 等. 姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用及其机制探讨[J]. 中国应用生理学杂志， 2014， 30(1)： 38-42.

[6] Weston AH, Absi M, Harno E,etal. The expression and function of Ca2+-sensing receptors in rat mesenteric artery; comparative studies using a model of type II diabetes [J].BrJPharmacol， 2008， 154(3)： 652-662.

[7] Li X, Zima AV, Sheikh F,etal. Endothelin-1-induced arrhythmogenic Ca2+signaling is bolished in atrial myocytes of inositol-1,4,5-trisphosphate(IP3)-receptor type 2-deficient mice[J].CircRes， 2005， 96(12)： 1274-1281.

[8] Vangheluwe P, Sipido KR, Raeymaekers L,etal. New perspectives on the role of SERCA2a Ca2+affinity in cardiac function[J].BiochimBiophysActa， 2006， 1763(11)： 1216-1228.

Decreased expression of calcium-sensing receptor involved in the progression of diabetic cardiomyopathy

JIA Zhen1, SUN Jian2, LI Hong-zhu3, LI Hong-xia3, PENG Xue3, SHAO Hong-jiang3,YANG Jin-xia3, XU Chang-qing3, BAI Shu-zhi3△

(1.Department of Peripheral Angiopathy, the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040;2. Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011; 3. Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086， China)

Objective: To observe the dynamic expression of calcium-sensing receptor(CaSR) in myocardium of diabetic rats. Methods: Thirty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups including control, diabetic-4 week and diabetic-8 week groups(n=10). The type 2 diabetes mellitus models were established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 30 mg/kg) after high-fat and high-sugar diet for one month. The cardiac morphology was observed by electron microscope. Western blot analyzed the expression of CaSR, phospholamban (PLN), a calcium handling regulator, and Ca2+-ATPase(SERCA) in cardiac tissues. Results: Compared with control group, the expressions of CaSR and SERCA were decreased, while the expression of PLN was significantly increased in a time-dependent manner in diabetic groups. Meanwhile diabetic rats displayed abnormal cardiac structure. Conclusion: These results indicate that the CaSR expression of myocardium is reduced in the progression of DCM, and its potential mechanism may be related to the impaired intracellular calcium homeostasis.

calcium-sensing receptor; diabetic cardiomyopathy; Wistar rat

国家自然科学基金(81200160，81270273,81270311, 81070123，81300163)；黑龙江省自然科学基金(QC2011C022)

2014-07-17 【修回日期】2014-10-17

R363.2

A

1000-6834(2015)01-035-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.011

△【通讯作者】Tel: 0451-86674548； E-mail: baishuzhi12@163.com