毛 郴 ,付元元 ,刘贵娟 ,赵 语
(1.重庆医科大学附属第一医院药学部,重庆 400016;2.重庆医科大学附属大学城医院药学部,重庆 401331)
牛蒡子 Fructus arctii为菊科牛蒡属植物牛蒡 Arctium lappa L.的干燥成熟果实。现代药理学研究证明,牛蒡子提取物有抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗菌、抗流感、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)和抑制血小板聚集等作用[1-4]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要有效成分,对于糖尿病及其微血管病变的临床应用前景值得期待[5]。本研究中采用正交试验设计,以牛蒡子苷含量为指标,优选出牛蒡子乙醇回流法的提取条件,再经大孔吸附树脂、硅胶H层析柱纯化精制,得到高纯度的牛蒡子苷。现报道如下。
高效液相色谱(HPLC)仪(美国Agilent 1100型);RE-5203A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);JY2002型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。牛蒡子苷对照品(中国食品药品检定研究院);牛蒡子药材(重庆桐君阁股份有限公司);AB-8型大孔吸附树脂(净化级),D101型大孔吸附树脂(净化级),均为南开大学化工厂产品;HPLC用甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
通过文献调研[6-8],确定乙醇回流提取法为适宜的牛蒡子苷提取方法。牛蒡子药材干燥,粉碎,过4号筛,索氏回流提取法,经6倍量石油醚脱脂3次,挥干石油醚,称重,得脱脂粉末;脱脂粉末经8倍量70%乙醇回流提取3次,每次1 h,合并提取液,旋转蒸发得乙醇提取液的浓缩浸膏。
色谱条件:色谱柱为 Diamonsil TMODS-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇 -水(1 ∶1.1);测定波长 280 nm;流速为0.6 mL/min;进样量为10 μL;柱温:室温。理论塔板数按牛蒡子苷峰计算应不低于1 500。
溶液制备:精密称取牛蒡子苷对照品10.00 mg,加流动相制备成40 g/L的牛蒡子苷对照品溶液。取浓缩浸膏,加流动相溶解后,定容至25 mL容量瓶中,摇匀,即得供试品溶液。
含量测定:分别吸取供试品溶液10 μL,注入高效液相色谱仪,按拟订色谱条件测定,外标法(面积归一法)计算牛蒡子苷的含量。
因素水平确定:根据预试验情况,选择乙醇体积分数(因素A)、回流次数(因素 B)、提取时间(因素 C)、溶剂用量(因素 D)为考察因素,每个因素选3个水平,以牛蒡子苷含量为考核指标,按 L9(34)正交试验表安排试验。正交试验因素水平见表1。
表1 牛蒡子苷醇提工艺正交试验因素水平
正交试验方法:各称取牛蒡子粗粉10.0 g(过4号筛),石油醚脱脂后,按表1方法1次提取,每种方法平行制备供试品液2份,4℃冰箱保存备用。按2.2项下方法测定含量,计算极差,结果见表2,方差分析见表3。由表2可知,因素D的极差最小,数据处理时作为最小误差项。由表3可知,各因素对牛蒡子苷醇提工艺影响程度依次为B>A>C>D。
表2 牛蒡子苷醇提工艺正交试验安排表及结果分析
表3 牛蒡子苷醇提工艺正交试验方差分析表
最佳工艺确定:根据直观分析,乙醇体积分数90%,回流3次,回流时间2.5 h,10倍溶剂量为最佳工艺。但为了节省成本和操作方便,选定牛蒡子苷的醇提工艺为:A3B3C2D2,即乙醇体积分数90%,回流次数3次,回流时间2 h,加8倍溶剂量。
吸附原液制备:取牛蒡子粗粉10.0 g,经石油醚脱脂后,70%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,浓缩干燥,经10%乙醇充分溶解,定容至100 mL,50摄氏度超声,静置24 h,过滤,备用。原液中牛蒡子苷的质量浓度约为5.08 g/L。
大孔吸附树脂预处理:将大孔吸附树脂(净化级)用95%乙醇浸泡24 h,充分溶胀后湿法装柱(300 mm×20 mm),继而用95%乙醇洗至流出液与水混合不产生浑浊,再用大量蒸馏水洗至无醇味,备用。
上样:将吸附原液缓慢滴加至大孔吸附树脂柱(径高比1∶8)中,吸附流速为1 BV/h。
水洗:原液吸附完成后,用蒸馏水洗,洗脱流速为1 BV/h,洗脱至molish反应呈阴性停止。用量约为1.5倍上样量。
醇洗:选择50%乙醇洗脱,洗脱流速为2 BV/h,用量为4倍上样量。
洗脱液浓缩:收集50%乙醇洗脱液,70℃旋转蒸发,挥干残留洗脱液。
硅胶H层析柱纯化牛蒡子苷:湿法装硅胶H层析柱,平衡1 h,吸取柱中多余洗脱剂,缓慢滴加用少量洗脱剂溶解大孔吸附树脂的粗分干燥物,等度洗脱,薄层色谱跟踪,与标准品对照收集单点流分。
重结晶收集牛蒡子苷纯品:45℃旋蒸已收集的单点流分,移取含有剩余少量洗脱剂的悬蒸产物,加入3B量的甲醇-水(1∶1.1)混合溶剂,重结晶,即得牛蒡子苷纯品。HPLC检测结果见图1,牛蒡子苷纯度为98.23%。
图1 HPLC检测牛蒡子苷色谱图
牛蒡子苷多经水或乙醇自牛蒡子干燥药材中提取得到[6-8]。本研究中采用正交试验方法,选择乙醇体积分数、回流次数、提取时间及溶剂用量4个因素进行考察,筛选出最优提取方案,所得粗提物中牛蒡子苷的纯度达90%以上。
大孔吸附树脂是一类人工合成的有机高聚物吸附剂,因其具有多孔性结构而具筛选性,又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性。程顺峰等[9]及孙瑜[10]等利用其对牛蒡子苷进行分离纯化。根据大孔吸附树脂的性质和文献分析,笔者选择常用于木脂素类化合物分离的AB-8型和D101型大孔吸附树脂进行预试验,动态吸附检测发现,D101型后者的流速较慢,且易堵柱,效率较低,故选择AB-8型进行牛蒡子苷的分离研究。本研究中对吸附原液的溶剂浓度进行优化,另外选择纯水作为粗分离时吸附原液的溶剂,除去水不溶物,提高了分离纯度。但由于牛蒡子的醇提物中含有大量的糖类,用水溶解会发生树脂化现象,大大降低牛蒡子苷的收率。
牛蒡子苷的纯化采用硅胶H层析柱、等度洗脱。牛蒡子苷极性较大,通过观察硅胶H层析柱的色带情况,判断开始收集含牛蒡子苷流分的时间,同时薄层色谱跟踪,合并单点流分。本研究中发现,层析柱的径高比、洗脱溶剂的配比选择等对牛蒡子苷的分离纯化效果影响较大,可根据试验具体条件逐一优化。
综上所述,本研究方法制备的牛蒡子苷纯度较高,但收率较低,不适合大量生产和制备,仅适用于对纯度要求较高的实验室或小规模研究。
[1]高 阳,董 雪,康廷国,等.牛蒡苷元体外抗流感病毒活性[J].中草药,2002,33(8):724 -726.
[2]王 潞,赵 烽,刘 珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作用研究进展[J].中草药,2008,39(3):467 -470.
[3]王丽萍,段晓颖,孙广科.复方牛蒡子含片体外抑菌作用研究[J].中国药业,2010,19(24):15 -16.
[4]郑曦孜,武 彬.牛蒡子防治糖尿病的研究进展[J].中国药业,2010,19(12):82 -83.
[5]付元元,赵 语.牛蒡子苷对糖尿病微血管病变的作用机制研究进展[J].重庆医学,2014,43(21):2 813 -2 815.
[6]卢来春,张 蓉,周世文,等.正交实验优化牛蒡子的提取工艺[J].儿科药学杂志,2007,13(1):10 -11.
[7]王 劲,史 辑,康廷国,等.均匀设计法优化牛蒡子中牛蒡苷的提取工艺[J].中药材,2004,27(2):127 -129.
[8]董文洪,刘 本.超临界流体提取牛蒡子中牛蒡子苷的实验研究[J].中国中药杂志,2006,31(15):1 240 -1 241,1 276.
[9]程顺峰,高 鹏.AB-8大孔树脂分离牛蒡子中木质素类成分研究[J].贵阳中医学院学报,2012,34(4):190-191.
[10]孙 瑜,何 凡,窦德强,等.大孔吸附树脂对牛蒡子中牛蒡苷的纯化工艺研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):13-15.