荠菜芳香成分的固相微萃取条件优化与分析

薛妍君,张 丽,冯 莉,姜 丽,郁志芳，*

(1.南京农业大学,江苏南京 210095;2.苏州市农科院,江苏苏州 215155)

荠菜芳香成分的固相微萃取条件优化与分析

薛妍君1,张 丽2,冯 莉1,姜 丽1,郁志芳1，*

(1.南京农业大学,江苏南京 210095;2.苏州市农科院,江苏苏州 215155)

采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用方法分析荠菜香气成分,并通过单因素对比实验优化萃取条件。结果表明:选用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头,萃取温度50℃、时间40min,解析温度250℃、时间3min萃取效果最佳;实验共鉴定有效香气成分64种,以醇类、醛类、烃类及含硫杂氧化合物为主。荠菜的特征香气成分主要有二甲基二硫、正己醛、叶醇、青叶醛、二甲三砜、2,6-二甲基环己醇、β-紫罗兰酮等。

荠菜,香气,固相微萃取(SPME),气相色谱-质谱联用(GC-MS)

香气是衡量果蔬品质的重要指标,固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)技术作为一种新的样品中挥发性和半挥发性有机物的分析方法,可与气相色谱(GC)、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)联用,因此,自20世纪90年代出现以来受到广泛关注并大量应用于各类食品、环境及生物样品的检测中[1-2]。目前,已通过SPME技术鉴别出香气成分的蔬果主要有桃子[3]、草莓[4]、樱桃[5]、哈密瓜[6]、龙眼[7]、冬瓜[8]、洋葱[9]、南瓜[10]等。

SPME萃取过程受萃取纤维涂层种类、萃取温度、平衡时间、解析温度及时间、无机盐添加量等很多因素影响,萃取参数不同,结果存在很大差异[11]。近年来,很多文献针对不同实验材料对SPME操作参数进行了优化介绍,但SPME分析荠菜中香气物质的研究鲜见报道。

荠菜为十字花科荠菜属,一、二年生草本植物,作为食物常以嫩茎、叶供食用,气味清香甘甜。由于富含谷氨酸等多种氨基酸,味道鲜美至极,被誉为“野菜之上品”。就香气而言,荠菜多呈现馥郁的草叶清香和蔬果香气,郭华等通过同时蒸馏萃取方法提取荠菜挥发油并确定其主要呈香物质为叶醇、乙酸叶醇酯及含硫化合物等[12],这与刘宇等通过水蒸气蒸馏法获得的荠菜挥发油成分略有差异。后者发现,荠菜挥发油中长链烷烃和有机酸类化合物含量较高,萜类及酯类化合物含量较低[13]。本文拟采用SPME与GC-MS联用分析荠菜香气成分,并通过萃取头的选择、萃取温度及时间、解析温度及时间等单因素优化实验,建立SPME萃取荠菜香气成分的最佳体系并明确荠菜芳香成分的组成和特征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生荠菜2012年11月采自南京郊外,成熟度一致、无机械损伤、无病虫害,经分级→清洗→除杂→去黄叶→剪除根部后沥干水分备用。

Trace GC-MS气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo公司;Tri-Plus自动进样器 美国Thermo公司;100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司;15mL萃取瓶 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料处理方法 选取大小相同、成熟度一致的荠菜500g,切成1cm长的小段,随机取样于液氮中研磨成细粉状[14],冻藏备用。取样重复三次。

1.2.2 SPME技术参数优化设计 以萃取头种类、萃取温度、萃取时间、解析温度及时间为单因素设计优化实验。萃取头选用100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS;萃取温度控制在30～70℃之间,设计30、40、50、60、70℃五个水平;萃取时间以20、30、40、50、60min为时间梯度。

解析温度及时间对比实验:设计230～270℃五个温度水平和1～5min五个时间水平,分别探究解析温度和时间对萃取结果的影响。

1.2.3 SPME操作方法 准确称取研磨好的荠菜2.0g于15mL萃取瓶中,用聚四氟乙烯衬里的硅橡胶垫密封后置于水浴锅中平衡20min,将固相微萃取头在气相色谱仪进样口老化,100μm PDMS老化温度250℃、时间0.5h;85μm PA 280℃老化1h;50/30μm DVB/CAR/PDMS老化温度270℃、时间1h。萃取吸附结束后将萃取头插入GC-MS进样口解析脱附。

1.2.4 GC-MS分析条件 GC条件:HP-5MS(30×0.25×0.25)色谱柱,反复实验确认升温程序为初温35℃,保留2min,以5℃/min的速度上升到80℃,保持1min;再以8℃/min上升至180℃,保留1min;最后以10℃/min上升至250℃,保留2min;进样口温度250℃,载气为He气,柱流量1mL/min,不分流进样。

MS条件:离子源温度200℃,电离方式EI,检测温度240℃,电子能70ev,灯丝电流150μA,扫描范围33～540。

1.2.5 图谱解析 通过对总离子色谱图峰的分析,经计算机与NIST Library和Wiley Library质谱库匹配,挑选出匹配度和反匹配度大于800(最大值1000)的信号峰,根据相对分子质量、化学式及分子结构确定峰物质名称。按峰面积归一化法计算百分含量。

1.2.6 数据统计 采用Excel 2007、SPSS18.0软件对数据结果进行统计处理及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 萃取参数优化

2.1.1 萃取头的选择 萃取头极性和厚度是固相微萃取技术的核心,对目标物萃取效果有直接影响,不同极性萃取头针对的目标物极性不同。本实验选用的三种不同类型萃取头,PA主要吸附极性半挥发性物质,PDMS吸附非极性挥发性物质,DVB/CAR/PDMS则对挥发性及半挥发性物质都有较好的吸附效果[15]。三种萃取头对新鲜荠菜风味物质的GC-MS总离子色谱图如图1所示。

由图1可知,DVB/CAR/PDMS萃取头对荠菜风味物质分离效果最好,捕集香气组分数最多,为61种,且涵盖了其它两种萃取头所检测到的大部分化合物;PDMS萃取头次之,分离香气组分23种,多为长链烷烃,对醇、醛等极性化合物分离效果不好;PA萃取头萃取效果最差,仅分离出19种香气成分,以脂肪酸等极性化合物为主,故而荠菜香气捕集时宜选用DVB/CAR/PDMS萃取头。

2.1.2 萃取温度的优化 萃取温度对香气物质的分离效果具有双重性。低萃取温度下香气物质挥发速度慢,达到动态平衡的时间长,且低沸点化合物比重增加;反之温度升高,萃取头吸附能力降低,萃取效率减小。另外,高温使部分香气组分发生异构化或裂解,影响分析结果的真实性[16-17]。实验设30～70℃五个温度水平,以归一法计算得到的总峰面积及总峰面积与峰数的比值为优化依据[18],经GC-MS分析,所得结果见图2。

随着萃取温度的升高,总峰面积和总峰面积/峰数值呈现上升趋势,其中30℃和40℃条件下,上升趋势缓慢,50℃出现吸附高峰,总峰面积和总峰面积/峰数值达到最大,且升高趋势极显著(p<0.01)。继续升高温度,二者数值均有不同程度降低,60℃降低趋势极显著(p<0.01),70℃显著(p<0.05)。高温导致峰面积下降的原因可能是分析物在萃取涂层与基质中的分配系数降低,影响了SPME的灵敏度。另外,高温条件下,低沸点化合物流失严重,并在与高沸点物质的竞争吸附中处于弱势地位,使得部分低沸点成分不能被吸附或吸附量减少[19]。综合以上结果,最佳萃取温度设定为50℃。

2.1.3 萃取时间的选择 萃取时间对萃取结果的影响如图3所示。40min前随着萃取时间的延长,总峰面积及其与峰数的比值均增加,说明香气物质的吸附量不断增大,20～40min内,总峰面积由3.2×109增加到4.1×109,变化极显著(p<0.01),峰面积/峰数值变化显著(p<0.05),40min时二者达到最大。50～60min,峰面积稍有降低,但降低趋势不明显(p>0.05),峰面积/峰数值趋于平衡,说明萃取头在40min即处于吸附饱和状态,继续延长时间不会改善吸附效果,这可能与待分析物的分配系数、样品基质及体积、萃取头涂层的物理化学性质有关[20],因此,选择40min为最佳萃取时间。

图1 不同萃取头分离效果比较Fig.1 Total ion chromatogram comparison of volatile flavor compounds extracted by PA(a)、 PDMS(b)and DVB/CAR/PDMS(c)coated fibers

图2 萃取温度对总峰面积(a) 和总峰面积与峰数比值(b)的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

相对于萃取温度,时间选择对香气物质总峰面积的影响要小得多。

图3 萃取时间对总峰面积(a) 和总峰面积与峰数比值(b)的影响Fig.3 Effect of extraction time on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

2.1.4 解析温度和时间对萃取结果的影响 解析作为固相微萃取操作的关键步骤,其温度和时间对结果有重要影响。解析温度过高,物质脱附速度快,解析时间短,但高温会缩短萃取纤维的使用寿命,同时造成一些香气物质发生氧化、裂解或异构化反应,影响实验结果的准确性;解析时间短易造成解析不完全,污染后续样品分析,而长时间解析则会导致峰形变宽,损害分离效果[21]。实验预设230～270℃五个温度水平和1～5min五个时间水平,分别探究解析温度和时间对总峰面积的影响,结果见图4。总峰面积随解析温度的升高和时间的延长不断增加,当温度达到250℃,时间为3min时,峰面积值基本稳定,继续升高温度或延长时间峰面积值无明显变化(p>0.05),因此确定最佳解析条件为250℃,3min。

表1 荠菜香气成分的GC-MS分析结果Table 1 Volatile composition of Capsella bursa-pastoris L

图4 解析温度(a)和解析时间(b)对总峰面积的影响Fig.4 Effect of desorption temperature(a) and time(b)on total peak area

2.2 香气成分分析

在最优萃取条件下对荠菜进行SPME萃取操作,经GC-MS检测并与NIST Library和Wiley Library质谱库匹配、筛选,最终确定荠菜中挥发性香气成分,结果见表1。

由表1可知,实验共检出荠菜有效香气成分64种,占出峰化合物总数的92.9%,峰面积和为总峰面积的91.3%,其中醛类物质种类最丰富,共检出18种;其次为醇类物质12种;碳氢化合物作为荠菜香气成分的重要组成部分,检出11种;另酯类信号峰6种,酸类3种,酮类2种。此外,含硫化合物,杂氧化合物(统称其它化合物)对荠菜香气组分也有较大贡献,共分离出12种,占种类总数的18.75%。刘宇等利用水蒸气蒸馏法提取荠菜挥发油,经GC-MS分析,共捕集45种化合物,占挥发油总量的70%[13];郭华等应用同时蒸馏-萃取法分析荠菜挥发性成分,只分离得到化合物组分17种[12]。本研究结果表明,SPME不仅能吸附荠菜中较多的挥发性物质成分,而且可提高芳香物质的检出率,因而是一种更有效的检测方法。

就含量而言,醇类物质和醛类物质的相对含量最高,为荠菜的主要香气成分,分别占总含量的26.65%和27.03%;其次是含硫及杂氧化合物,相对含量21%;碳氢化合物的相对含量也较高,为7.98%,分别是酯类、酸类、酮类物质的2.46、2.17、4.67倍。

续表

色谱图中,各香气组分出峰时间集中在34min前,尤其以10～25min内出峰数量最多,化合物相对含量最高,主要出峰物多为醇类、醛类、酯类等低沸点化合物,其中含量较高的组分有正己醛、2-甲基-4-戊烯酸、叶醇、青叶醛、反式-2-己烯-1-醇、顺-4-庚烯醛、苯甲醛等,相对含量分别为5.28%、2.17%、6.84%、3.89%、4.91%、1.99%和5.64%,这些多物质大都呈现草叶清香和蔬果香,部分物质有鲜果、油脂香气。萃取后期,烷烃类、杂氧化合物等高沸点物质居多,大部分物质含量较低,但有些化合物如2-正戊基呋喃、桉叶油素、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪等香气强度高且香气阈值低,因此对整体香气的贡献作用不可忽视[22]。

值得注意的是,荠菜中含硫化合物含量相当丰富,二甲基二硫、二甲三砜、二甲基四硫等硫化物含量高达14.6%,这与郭华等人的研究结果一致[12]。

3 结论

SPME萃取荠菜香气成分的最优萃取参数为:取2g样品于15mL萃取瓶中,选用50/30μmDVB/CAR/PDMS纤维萃取头,50℃平衡20min,萃取40min,解析温度250℃,解析时间3min。

优化条件下共分离出有效荠菜香气成分64种,占化合物总数的92.9%,峰面积和占到总峰面积的91.3%,种类从多到少分别为醛类18种、醇类12种、碳氢化合物11种、酯类6种、酸类3种、酮类2种、其它化合物12种,相对含量分别为27.03%、26.65%、7.98%、3.25%、3.68%、1.71%和21%。

荠菜香气组分主要由醛类、醇类、酯类及含硫化合物等组成,特征化合物包括二甲基二硫、正己醛、叶醇、青叶醛、二甲三砜、2,6-二甲基环己醇、柠檬醛、β-紫罗兰酮等,这些物质共同作用形成了荠菜特有的香气特征。

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Optimization and analysis of volatile components ofCapsellabursa-pastorisLby SPME-GC-MS

XUE Yan-jun1,ZHANG Li2,FENG Li1,JIANG Li1,YU Zhi-fang1,*

(1.Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;(2.Suzhou Academy of Agricultural Sciences,Suzhou 215155,China)

SPME-GC-MS was used to analysis volatile components ofCapsellabursa-pastorisand the extraction conditions were investigated. Experimental results showed that the optimal SPME extraction time and temperature were 40min and 50℃,while the desorption time and temperature were 3min and 250℃ by using DVB/CAR/PDMS fiber. A total of 64 volatile components were identified mainly of which were aldehydes,alcohols,hydrocarbons and other compounds including sulfide and heterocycle. The characteristic volatile components ofCapsellabursa-pastoriswere disulfide,dimethyl;Hexanal;3-Hexen-1-ol;2-Hexenal,(E)-;Dimethyl trisulfide;Cyclohexanol,2,6-dimethyl-;3-Buten-2-one,4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-and so on.

Capsellabursa-pastorisL;volatile components;SPME;GC-MS

2014-03-10

薛妍君(1987-)，女，硕士研究生，研究方向：果蔬采后生物学。

*通讯作者:郁志芳(1960-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏。

江苏省农业科技自主创新资金( CX(13)5076)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)01-0328-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.061