牦牛乳酪蛋白降血压肽制备工艺及分离纯化研究

宋 礼，孙文静，纪银莉，冯 丹，刘 恭，谢小冬

(1.甘肃华羚生物技术研究中心,甘肃兰州 730000；2.兰州大学基础医学院,甘肃兰州 730000)

牦牛乳酪蛋白降血压肽制备工艺及分离纯化研究

宋 礼1，孙文静1，纪银莉1，冯 丹1，刘 恭1，谢小冬2，*

(1.甘肃华羚生物技术研究中心,甘肃兰州 730000；2.兰州大学基础医学院,甘肃兰州 730000)

研究了胰蛋白酶制备降血压肽的最佳水解条件和分离纯化工艺。通过单因素、正交实验,确定了最佳水解条件胰蛋白酶添加量2.5%,温度37℃,最适pH8.0,反应时间2.5h,水解产物抑制血管紧张素转化酶的能力为85.26%；通过液相色谱及质朴检测,得到降血压肽的序列片段为HQGLPQEVLNENLLR、AVPYPQR和TKVIPYVR。

降血压肽,制备,纯化

酪蛋白(casein)由动物乳腺上皮细胞合成,是乳蛋白中最主要的蛋白质,约占其蛋白总量的80%。在pH4.6,温度20℃的条件下,从脱脂乳中沉淀下来的蛋白质就是酪蛋白[1]。牛乳酪蛋白中蕴藏着许多具有生物活性的多肽,这些多肽在母体蛋白质序列内是无活性的,通过水解的方式释放出来后即可成为活性肽。这些多肽物质具有很多功能特性,如阿片活性、抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性、免疫调节活性、结合矿物质的活性、抗血栓活性、抑菌活性、降血脂活性等。国内一些学者对酶水解蛋白制备降血压肽制备工艺报道居多[2-4],对其降血压功能也有研究[5],但是对水解产物中降血压肽的分离纯化及结构分析报道较少。其目前,降血压肽的主要制备方法有:酶解法,发酵法和自溶法。基因工程技术这一新颖的方法,在药物生产以及食品原料过程中的应用已越来越多,利用基因工程技术制备降血压肽目前也有所借鉴和发展。这4种方法中酶法水解具有反应条件温和、专一性强、副产物少以及易于控制等特点,既不会导致营养成分的损失,也不会产生毒理性问题,已成为研究过程中使用最多的一种方法。常用的酶制剂有碱性蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、胰蛋白酶[8]、Alcalase[9]等。降血压肽的分离提取常用的方法包括:超滤[10]、离子交换层析[11]、凝胶过滤层析、高效液相色谱、反向高效液相色谱、薄层色谱毛细管电泳等。本研究通过研究降血压肽的制备工艺及分离纯化方法,为开发高附加值食源性的降血压肽产品以及进一步研究食源性降血压肽的氨基酸一级结构及作用机理提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食品级牦牛乳酪蛋白 购自甘肃华羚酪蛋白股份有限公司；胰蛋白酶 购自北京恒源生物科技有限公司；兔肺丙酮粉 购自sigma；FAPGG 购自上海强耀生物科技有限公司；其他生化试剂 均为国产分析纯。

UV2450紫外可见分光光度计 日本SHIMADZU；pH计 梅特勒；高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ACE抑制率测定 ACE酶液:50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4℃硼酸缓冲液(pH8.3,100mmol/L)中,4℃保持12h后4℃、20000r/min离心40min,收集上清液并4℃保。

FAPGG底物溶液:将FAPGG溶于100mmol/L的硼酸冲液(含300mmol/L的NaCl,pH8.3),配制成1.6mmol/L溶液。

500μL FAPGG底物溶液与100μL超纯水或抑制剂ACE抑制肽或卡托普利)混匀,37℃预热2min,加入100μL ACE酶液开始反应,30min后立即加入100μL EDTA(100mmol/L)终止反应,加入4000μL超纯水稀释,实验平行3次。0min样品的测定,要先加入EDTA再加入ACE酶液,其他相同。于340nm波长处分别测系在0min和30min时的吸光度,计算差值ΔA(ΔA=A0min-A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力,抑制剂对ACE的抑制程度用(2)式计算[12]。

式中:ΔAc为加入超纯水时吸光度在30min内的变；ΔAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。

半抑制浓度(IC50)定义为抑制50% ACE酶活力时抑制剂浓度。配制不同浓度的ACE抑制剂(nmol/L或mg/mL)上述步骤测定其ACE抑制率,以lg抑制剂的浓度横坐标,ACE抑制率(%)为纵坐标,进行回归分析回归方程,利用回归方程计算抑制剂的IC50。

1.2.2 酶解工艺优化

1.2.2.1 温度对水解条件的影响 设置反应温度30、35、40、45和50℃单因素条件,以酶添加量1%,pH7.0,反应1h,进行水解反应,以ACE酶抑制率为考核指标,研究酶的最佳反应温度。

1.2.2.2 pH对水解条件的影响 设置pH为6.5、7.0、7.5、8.0和8.5单因素条件,以胰蛋白酶添加量1%,反应温度40℃,反应1h,进行水解反应,以ACE酶抑制率为考核指标,研究最佳水解pH。

1.2.2.3 酶添加量对水解条件的影响 设置酶添加量1%、1.5%、2%、2.5%和3%单因素条件,以反应温度40℃,pH8.0,反应1h,进行水解反应,以ACE酶抑制率为考核指标,研究最佳添加量。

1.2.2.4 时间对水解条件的影响 设置反应时间1、1.5、2、2.5和3h单因素条件,以酶添加量2%,反应温度40℃,pH8.0,进行水解反应,以ACE酶抑制率为考核指标,研究酶的最佳反应时间。

1.2.2.5 正交组合实验 设计4因素3水平正交实验,以降血压活性为衡量指标,研究胰蛋白酶水解酪蛋白制备降血压肽最佳工艺参数。因素水平表见表1。

表1 水解条件因素水平表Table 1 Factors and levels of hydrolysis conditions

1.2.3 分离纯化实验

1.2.3.1 葡聚糖凝胶分离 采用葡聚糖凝胶柱对离子交换分离产物进行分离。将Sephadex G-15用蒸馏水平衡后装柱(12mm×450mm),通过超滤膜对水解产物进行初分离,选用分子量在200～2500u的样液0.1g进行上样,洗脱液为磷酸缓冲液,流速1d/6s,分管收集,每管1.5mL,收集70管,在280nm处分别测定各峰的活性。

1.2.3.2 色谱检测 对凝胶分离的抗氧化肽进行色谱纯度分析。取葡聚糖凝胶分离的高活性ACE抑制肽进行高效液相色谱检测。检测条件:流动相A液为纯净水,B液为无水乙腈+0.1%TFA,280nm C18柱,柱温28℃,流速为0.5mL/min,进样体积是20μL,梯度洗脱见表2。

表2 梯度洗脱条件Table 2 Gradient elution conditions

1.2.3.3 质谱检测 通过MALDI-TOF/TOF质谱仪对降血压肽进行分子量进行质谱测定,确定水解产物分子量。,该实验方法及结果有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组学研究分析中心检测完成。

1.2.3.4 序列测定 用质谱对降血压肽进行N端氨基酸序列分析,通过CNBI酪蛋白数据进行数据比对,确定降血压肽肽活性序列。

1.3 数据分析方法

2 结果与分析

2.1 温度对水解条件的影响

由图1可以看出,随着温度的逐步升高,胰蛋白酶的水解活性增强,水解产物中ACE的活性也逐渐增高。当温度达到一定程度后,因高温造成蛋白酶部分失活,水解产物的ACE活性也逐渐降低。当温度为40℃时,产物有最大的ACE抑制率,抑制率达到65.3%。

2.2 pH对水解条件的影响

胰蛋白酶只有在最佳的pH条件下才能更好的发生酶解反应,由图2可以看出,胰蛋白酶在pH8.0条件下,水解产物有最大的ACE酶抑制率57.2%。

图1 温度对ACE活性的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on the degree of hydrolysis

图2 pH对ACE活性的影响Fig.1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.3 酶添加量对水解条件的影响

由图2可以看出,随着酶的添加量增大,水解产物的水解度逐渐增大,水解产物中肽的生成量逐渐增多,当添加量为底物的2%时,水解产物的ACE酶抑制率基本达到顶峰,ACE酶抑制率为为60.1%,当添加量为底物的3%时,水解产物的ACE抑制率为63.1%。

图3 添加量对ACE活性的影响Fig.3 Effect of addition on the degree of hydrolysis

2.4 时间对水解条件的影响

由图4可以看出,随着水解时间的延长,底物不断被水解,产物的ACE抑制率也逐渐增大。通过实验发现,水解反应2h后,水解产物的ACE酶抑制率66.1%,基本达到顶峰。对比反应2.5h产物ACE抑制率为66.7%和反应3h产物ACE抑制率67.1%,产物的ACE酶抑制率差别不大,考虑到实验周期及生产成本,实验选择2.5h作为本实验的水解时间。

图4 时间对ACE活性的影响Fig.4 Effect of reaction time on the degree of hydrolysis

2.5 正交组合实验

正交组合实验结果见表3。

表3 正交组合实验结果Table 3 The results of orthogonal combination test

由正交实验可以看出,4个因素的主次顺序为A、C、B、即添加量、pH、温度。根据以上数据进行显著性检验,结果见表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

通过方差分析可知,添加量对ACE酶抑制率有显著影响。最佳实验组合为添加量为2.5%,温度37℃,pH8.0,时间为150min,在最佳条件下,水解产物的ACE抑制率达到85.26%。

2.6 葡聚糖凝胶分离

酪蛋白水解产物中,肽分子大小是连续分布的,即水解物中存在着大小不等的肽分子,通过Sephadex G-15对除盐酶解液进行分离纯化,磷酸缓冲液进行洗脱,在280nm

表5 降血压肽氨基酸序列分析Table 5 Amino acid sequence analysis of antihypertensive peptide

处收集有吸收的样液共50管。对收集到的各管样液进行ACE抑制肽活性检测,结果表明,18号样液ACE抑制率64.7%、19号样液ACE抑制率52.4%,抑制率相对较高。蛋白洗脱曲线图如图5所示:

图5 收集液OD值Fig.5 The OD value of collect liquid

2.7 色谱检测

对18、19号样液进行高效液相色谱检测,结果如图6所示。通过色谱比对,均在14min和20min处出现色谱峰,而且20min时的色谱峰有较高的峰值。说明2个收集管存在相同物质。

图6 降血压肽高效液相色谱图Fig.6 The HPLC spectrogram of antihypertensive peptide

2.8 质谱检测

对18号样液进行质谱检测,结果如图7所示。由图可以看出,分离出的降血压肽有3个明显的质谱峰,分子量分别为830u,在977u和1760u。

图7 降血压肽质谱图Fig.5 The mass spectrogram of antihypertensive peptide

2.9 序列测定

对分离出的降血压肽进行氨基酸序列测定,结果如表5所示,结合质谱检测可以看出,来自a-S2酪蛋白的198-205的氨基酸序列是降血压肽的主要成分。

3 结论

实验得到了胰蛋白酶最佳水解条件为胰蛋白酶添加量2.5%,温度37℃,pH8.0,反应2.5h,水解产物有最强的ACE酶抑制率,抑制率达到85.26%。通过葡聚糖凝胶柱对降血压肽进行分离纯化,利用高效液相色谱检测纯度并进行氨基酸序列测定,通过与NCBInr蛋白数据库进行比对,得到降血压肽氨基酸序列分别为HQGLPQEVLNENLLR(1760u)、AVPYPQR(830u)和TKVIPYVR(997u),分别来自as1酪蛋白8-22,β-酪蛋白177-183和as2酪蛋白198-205。其中,来自as2酪蛋白198-205片段是降血压肽的主要成分。

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Study of preparation and purification process ofantihypertensive peptides from Yak milk casein

SONG Li1,SUN Wen-jing1,JI Yin-li1,FENG Dan1,LIU Gong,XIE Xiao-dong2,*

(1. Gansu,Hua Ling Biotechnology Research Center,Lanzhou,Lanzhou 730000,China;2. school of basic medical sciences,Lanzhou University,Lanzhou,Lanzhou 730000,China)

To prepare the antihypertensive peptides,the optimal enzymatic hydrolysis conditions of Trypsin and purification process were studied.The optimal hydrolysis conditions were determined by single factors and orthogonal experiments,and the optimum hydrolysis conditions were temperature 37℃,pH8.0,trypsin added 2.5%,with reaction 2.5h,the capacity of angiotensin-converting enzyme inhibition was 85.26%. Hydrolyzates were separated and purified by high performance liquid chromatography(HPLC)and mass spectrometry,and the amino acid sequences were HQGLPQEVLNENLLR,AVPYPQR and TKVIPYVR.

antihypertensive peptides;preparation;purification

2014-04-29

宋礼(1984-),男,硕士,研究方向:食品科学。

*通讯作者:谢小冬(1969-),男,博士,教授,研究方向:生物工程。

牦牛乳资源利用及系列产品关键技术合作研发(国际科技合作重点项目计划2011DFA32550)。

TS252.1

B

1002-0306(2015)03-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.038