急性百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液及血清炎性因子变化及姜黄素的干预效果

陈寿权，冷巧云，何爱文，刘玉荣，李惠萍，李章平，黄唯佳，程俊彦

急性百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液及血清炎性因子变化及姜黄素的干预效果

陈寿权，冷巧云，何爱文，刘玉荣，李惠萍，李章平，黄唯佳，程俊彦

目的：观察百草枯（PQ）中毒大鼠急性肺损伤模型支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的变化及姜黄素的干预作用。方法：成年雄性SD大鼠随机分成对照组、中毒组、干预组。中毒组腹腔注射PQ 15mg/kg，干预组腹腔注射姜黄素200mg/kg，15min后腹腔注射PQ 15mg/kg，对照组腹腔注射生理盐水1ml。各组分别按腹腔染毒或注射后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d时间点分5个亚组。ELISA法测定各亚组大鼠BALF和血清IL-1β、TNF-α含量，光镜下观察各组大鼠肺组织病理变化。实验数据统计采用单因素方差分析，组间比较用Bonfer roni法，相关性分析采用Pearson相关性检验。结果：与对照组比较，中毒组和干预组BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后6 h、24 h、3 d、7 d均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），而中毒组BALF的IL-1β水平在染毒后3 h已开始升高（P＜0.01）；与中毒组比较，干预组BALF和血清IL-1β和TNF-α水平在染毒后24 h、3 d、7 d均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；中毒组、干预组BALF与血清IL-1β、TNF-α水平具有相关性。中毒组病理改变严重，干预组病理改变较中毒组减轻。结论：PQ中毒大鼠肺组织炎性细胞浸润，BALF和血循环中TNF-α、IL-1β等炎性因子释放增加，启动肺及全身炎症反应，可能是大鼠PQ中毒急性肺损伤的基本机制之一，姜黄素可通过此信号通路在一定程度上减轻肺损伤和全身炎性反应。

百草枯；中毒；肺损伤；炎性因子；姜黄素

[Key words]paraquat；poison；lung injury；inflammatory factor；curcumin

百草枯（PQ）是剧毒类除草剂，对人畜毒性极强。在我国及亚太地区，PQ中毒在农药中毒中很常见。中毒患者病死率高达50%～80%[1-2]。肺脏为PQ中毒的主要靶器官，肺组织白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症介质大量释放，炎症反应与氧化应激反应相互促进，导致中毒早期的急性肺损伤[3-4]。炎症因子与后期的肺纤维化也密切相关[5]。姜黄素是从中药姜黄属植物的根茎中提取的一种酚性色素，近年研究发现姜黄素具有广泛药理作用，包括抑制炎症细胞浸润、减轻炎症反应、肺损伤等作用[6-8]。本研究通过建立大鼠急性PQ中毒模型，观察支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清IL-1β、TNF-α水平的变化以及姜黄素的干预影响，旨在为揭示在PQ致急性肺损伤及全身炎性反应过程中姜黄素的干预效果提供进一步的实验证据。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠120只[许可证号：SCXK（沪）2007-0005]，体重280～300 g；20%百草枯溶液（江苏南通先正达公司）；姜黄素、玉米油（美国Sigma公司）；IL-1β及TNF-α ELISA试剂盒（美国R&D公司）。Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及PQ中毒模型 SD大鼠随机分成对照组、中毒组、干预组，对照组按腹腔注射后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d各亚组（n=8），中毒组、干预组各按染毒后3 h、6 h、24 h、3 d、7 d各亚组（n=8）。对照组腹腔注射生理盐水1ml，并于24 h后处死取材；中毒组给予生理盐水稀释PQ（15mg/kg）至1ml一次性腹腔注射，干预组给予玉米油溶解后的姜黄素混悬液（200mg/kg）一次性腹腔注射，15min后给予生理盐水稀释PQ（15 mg/kg）至1ml一次性腹腔注射。各亚组分别于相应时间点被处置取材。

1.2.2 血液的留取及BALF的制备 5%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉大鼠，开胸，经左心室穿刺采血3ml，置于离心管中自凝3 h待检；采血后处死大鼠，分离气管及主支气管，在近气管分叉处结扎右主支气管，将磨平的10ml注射器针头插入气管内，直至左主支气管末端后固定，缓慢注入3ml无菌生理盐水进行支气管肺泡灌洗，待30 s后缓慢回抽，重复两次（总共9ml生理盐水），回收率均在80%以上，BALF置于离心管中，于4℃储存，1 h内离心，记录BALF的回收量。

1.2.3 血清及BALF中IL-1β、TNF-α浓度测定将留取的血液1500 r/min离心5min，提取血清；取BALF经1500 r/min离心10min后取上清液，血清与BALF上清液储存于-20℃低温箱中待测，采用ELISA法测定血清及BALF中IL-1β、TNF-α的水平，操作严格按照试剂盒说明书执行。

1.2.4 肺组织病理学检查 染毒后6 h，24 h，3 d，7 d取大鼠右肺组织，用4%多聚甲醛固定24 h，垂直气道取材，酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片4μm厚。行常规HE染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件分析，符合正态分布的数据以均数±标准差（）来表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间比较采用Bonfer roni法，以P＜0.05为显著差异。

2 结果

2.1 各组BALF和血清IL-1β、TNF-α水平变化

与对照组各相应时间点（亚组）比较，中毒组和干预组BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后6h、24h、3 d、7 d均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），而中毒组BALF的IL-1β水平在染毒后3 h已开始升高（P＜0.01）；与中毒组比较，干预组BALF和血清TNF-α、IL-1β水平在染毒后24 h、3 d、7 d均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

2.2 BALF与血清IL-1β、TNF-α水平相关性分析

中毒组BALF与血清的IL-1β水平呈正相关（r= 0.7198，P＜0.05），TNF-α水平亦呈正相关（r= 0.8476，P＜0.05）；干预组BALF与血清的IL-1β水平呈正相关（r=0.5572，P＜0.05），TNF-α水平亦呈正相关（r=0.6894，P＜0.01）。

2.3 光镜下肺组织病理学改变 （1）对照组光镜下可见肺泡结构完整，肺泡壁薄，肺泡间隔无增宽及充血，肺泡内无炎性细胞浸润及出血现象。见图1-A。（2）中毒组6 h可见肺泡结构模糊，部分肺泡腔内有水肿液，肺间隔炎性细胞浸润；24 h见肺泡腔内充满粉色水肿液，肺泡腔及间隔大量炎症细胞浸润，肺泡间隔毛细血管扩张、充血；3 d见肺泡腔内水肿液及炎性细胞稍减少，出现肺泡间隔增宽现象；7 d见炎症细胞浸润较少、水肿不明显，但肺泡间隔明显增宽，出现肺泡塌陷。见图1-B、1-C、1-D、1-E。（3）干预组6 h、24 h、3 d、7 d各时间点可见炎性细胞浸润、肺泡内渗出液及肺间隔增宽均较染毒组程度减轻。见图1-F、1-G、1-H、1-I。

表1 各组大鼠血清和BALF中IL-1β、TNF-α水平的比较（pg/ml，）

表1 各组大鼠血清和BALF中IL-1β、TNF-α水平的比较（pg/ml，）

注：与对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与中毒组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；BALF，支气管肺泡灌洗液；肿瘤坏死因子-α，TNF-α；白介素-1β，IL-1β

组别 时间点(亚组)血清TNF-α BALF TNF-α IL-1β IL-1β对照组3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 128.12±3.12 131.05±2.99 126.67±3.47 133.21±3.01 128.83±3.34 4.34±1.04 3.89±0.89 4.11±1.11 3.69±1.03 4.24±0.98 623.18±10.52 663.93±13.25 622.91±11.74 645.23±12.49 638.38±11.37 13.53±2.14 15.25±1.89 14.82±2.01 16.03±2.56 13.89±2.29中毒组3 h 6 h 24 h 3 d 7 d 161.95±3.69 186.89±4.31**223.12±9.39**235.95±6.06**378.12±2.67**9.83±1.52**21.22±0.56**21.78±1.18**16.86±0.24**12.01±0.69**1020.73±18.27 1543.29±27.28**1862.67±26.51**2111.20±25.19**2567.62±30.19**19.28±3.91 30.19±3.67**35.87±4.01**27.84±3.19**24.91±2.89**干预组3 h 6 h 24 h 3 d 7 d n 88888 88888 88888 139.01±8.00 152.29±4.53*168.32±7.68**##218.73±7.73**#249.85±8.85**##6.73±1.51 19.10±0.68**11.73±1.55**##6.54±0.47*##6.34±0.88*##659.56±16.92 1489.23±28.17**1627.93±30.25**##1982.29±29.77**##2102.91±32.01**##18.22±2.89 28.28±3.69**27.88±3.37**##21.17±2.76**#19.89±3.13*#

3 讨论

图1 各组大鼠肺组织光镜下病理学改变（HE×100）

TNF-α是由巨噬细胞释放的前炎症因子，能增加炎症趋化因子和其他因子的释放，并增加血管的通透性，最终导致白细胞的激活及大量炎症因子的产生，是炎症介质“瀑布”样反应的始动因子，可动员、趋化、黏附、聚集、激活中性粒细胞（PMN），其作用贯穿机体炎性反应的全过程[9]。IL-1β对巨噬细胞及PMN有趋化及黏附作用，通过释放炎症介质、上调黏附分子、上调组织因子、下调血栓调节蛋白（TM）、激活血管内皮细胞等生物学效应，在炎症反应的发生发展过程中发挥着重要的协同作用，增强TNF-α的损伤作用[10-12]。炎症因子可直接引起肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛损伤、毛细血管通透性增加、肺水肿及肺血管内微血栓形成，TNF-α可诱导急性肺损伤（ALI）发生，降低血浆中TNF-α含量可使大鼠肺组织损伤程度减轻[13-15]。

研究显示，PQ中毒可致大鼠肺组织中的TNF-α和IL-1β的表达量显著升高[16]，其机制与PQ中毒后产生大量活性氧自由基刺激炎症细胞因子释放参与炎症反应相关[17]。本研究中中毒组染毒后6 h、24 h、3 d、7 d各时间点BALF和血清的TNF-α、IL-1 β均较对照组显著升高，其中BALF的IL-1β水平更是在染毒后3 h已开始升高。肺组织病理改变严重，表明肺组织炎性细胞浸润，支气管肺泡和血循环中TNF-α、IL-1β等炎症因子释放增加，启动肺与全身炎症反应，是PQ中毒ALT的基本机制之一。

姜黄素是从中药姜黄属植物的根茎中提取的一种酚性色素，通常作为调味品及化妆品使用，研究发现Cu2+具有较强的抗炎、抗氧化、降脂、抗诱变、抗肿瘤等作用[18]。用姜黄素干预脓毒症大鼠模型，发现其肺组织超氧化物歧化酶表达水平增加，BALF中的TNF-α、IL-8及巨噬细胞移动抑制因子显著减少，大鼠肺水肿程度减轻，72 h存活率提高[19]。姜黄素可抑制脂多糖所诱导的TNF-α、IL-1β过度表达，进而减轻气道炎症反应[20]。姜黄素能减轻氧化应激及炎症反应，对ALI起保护作用[21]。本研究发现，干预组肺组织血清和BALF中TNF-α、IL-1β浓度在染毒后24 h、3 d、7 d均显著低于中毒组，肺组织病理变化程度也显著轻于中毒组，初步提示姜黄素干预处理能通过减少PQ中毒大鼠肺组织中炎性细胞浸润，抑制TNF-α、IL-1β的释放，减轻肺组织炎症反应和ALI程度，同时减轻全身炎性反应。

在中毒组或干预组，BALF与血清的TNF-α、IL-1β水平之间均呈正相关，表明PQ中毒后肺组织和全身的炎性反应损伤程度具有密切的相关性，而姜黄素干预对肺组织和全身炎性反应损伤的抑制作用也具有协同性，值得从延长时间窗和从不同剂量进一步观察研究。

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（收稿：2015-06-09 修回：2015-10-05 编校：齐 彤）

I nfluence of curcum in on changes of inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid and serum in acute paraquatpoisoned rats

C HEN Shou-quan，LENG Qiao-yun，He Ai-wen，LIU Yu-rong，LI Hui-ping，LI Zhang-ping，HUANG Wei-jia，CHENG Jun-yan.Department o f Emergency，The First Affiliated Hospital ofWenzhou Medical Uni⁃versity，ZhejiangWenzhou 325000,China

Objective：To study the changes of interleukin-1β(IL-1β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and serum in ratsw ith acute paraquat(PQ)poisoning,and the intervention effectof curcumin.Methods：A total of 120 adultmale Sprague-Dauley(SD)ratswere random ly divided into control,PQ-poisoned and curcum in-intervened groups.Rats in PQ-poisoned group,curcum in-intervened group,controlgroupwere intraperitoneally adm inisteredw ith PQ 15mg/kg,PQ 15mg/kg at 15min after curcumin 200mg/kg,normal saline(NS)1m l,respectively.Each group divided further into 5 subgroups by time pointsat3 h,6 h,24 h,3 d,7 d after intraperitoneal contam ination or injection.The levelsof IL-1β,TNF-αin serum and BALFwere measured w ith enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA).Pathological changes in lung were observed by lightm icroscope.Experimental datawere treated w ith single-factor analysisof variance and compared between groupsby Bonferronimethod,and correlation analysiswas performed by Pearson correlation coefficient.Results：Compared w ith the controlgroup,TNF-αand IL-1βlevels in BALF and serum increased significantly at6 h,24 h,3 d,7 d after PQ exposure in PQ-poisoned group and curcum in-intervened group(P<0.05 or P<0.01)，and IL-1βlevels in BALF of PQ-poisoned group had increased significantly at3h after PQ exposure(P< 0.01).Compared w ith the PQ-poisoned group,TNF-αand IL-1βlevels in BALF and serum decreased significantly at24 h,3 d,7 d after PQ exposure in curcum in-intervened group(P<0.05 or P<0.01).The levelsof IL-1βand TNF-αwere relevant between BALFand serum in PQ-poisoned group and curcum in-intervened group.Pathological changes of lung tissue weremore serious in PQ-poisoned group than curcumin-intervened group.Conclusion：Neutrophil infiltration in lung tissue,increased releasing of IL-1β and TNF-αin BALF and blood circulation,and then initiating pulmonary and system ic inflammatory responses could be one of the basicmechanisms of PQ-induced acute lung injury in rats.Curcum in could reduce lung injury and system ic inflammatory response to someextentby thissignaling pathway.

R 595.4

A

2095-3496（2015）04-0207-05

浙江省中医药科技计划项目（2010ZA082）

325000 浙江温州，温州医科大学附属第一医院急诊科（陈寿权，何爱文，李惠萍，李章平，黄唯佳，程俊彦）；江西九江，九江市第一人民医院急诊科（冷巧云）；广东珠海，珠海市人民医院急诊科（刘玉荣）