C型凝集素CLEC4M对HCVcc易感性的影响

朱婷 聂青和 王媛媛 高禄化 龙振昼 李汨

目前，对于丙型肝炎尚无有效的预防性疫苗［1］。由于细胞受体是HCV入侵宿主细胞的门户，是抗病毒药物最佳靶点之一。因此，HCV受体一直是研究热点，它对于今后有效控制HCV感染及其药物的研发具有重要意义［2］。HCV受体主要包括CD81、B族I型清道夫受体（scavenger receptor class B typeI，SRBI）、紧密连接蛋白家族、低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）、树突状细胞特异性细胞间黏附分子－3－结合非整合素分子（DCSIGN）等［3］。研究表明，C型凝集素CLEC4M可能是介导HCV入胞的重要分子［4］。为此，本研究构建了GV166－CLEC4M慢病毒载体，使其在 Huh7.5细胞过表达，获得稳定过表达CLEC4M的细胞系，应用HCV体外培养系统，即体外培养的 HCV（cell cultured HCV，HCVcc）感染过表达 CLEC4M 的Huh7.5细胞，了解CLEC4M的表达对HCVcc易感性的影响。

资料和方法

一、材料

人肝癌细胞系Huh－7.5细胞、包含HCV全长序列的载体pFL－J6/JFH 由本室保存，GV166－CLEC4M慢病毒载体由本室构建并保存；DMEM、胰蛋白酶、FBS、NEAA购自美国Gibco公司；XBaI购自立陶宛MBI Fermentas公司、蛋白酶 K、RNA Marker RL 5000为TaKaRa公司产品；PageRulerTM 蛋白marker购自中国Fermentas公司；GenEluteDNA纯化试剂盒为美国Sigma公司产品；PureLink质粒小量提取试剂盒为美国Invitrogen公司产品；T7 AmpliScribe体外转录试剂盒为美国Thermo公司产品；RNeasy RNA Mini Kit为德国Qiagen公司产品，抗GFP多克隆抗体购自美国eBioscience公司，鼠抗人CLEC4M抗体、兔抗人HCV NS5a抗体、山羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司，HCV荧光定量试剂盒购自深圳凯杰生物工程有限公司。

二、方法

（一）HCVcc的培养及感染测定 参照文献［5］。将 HCV pFL－J6/JFH－1（2a基因型）质粒10μL（浓度200 ng/μL），加入限制性内切酶 XbaI 2μL，37℃水浴，酶切3.5 h，使质粒线性化。按照GenElute DNA纯化试剂盒操作说明书，进行线性化DNA纯化。采用紫外分光光度计检测DNA纯化后的浓度。按照Thermo Scientific TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit操作说明对DNA模板进行体外转录，然后按照Qiagen RNeasy试剂盒操作说明，纯化RNA产物，测定浓度，分装。提前将Huh7.5细胞铺至6孔培养板中，显微镜下观察融合度达80%左右时，将Huh7.5细胞培养上清弃去，用DMEM洗涤。提前对Opti－MEM和转染试剂DMRIE－C进行混匀，待细胞准备好时加入6孔培养板中，并设置对照孔（只加入Opti－MEM）。37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱内，培养4 h后，将转染液倒掉，加入2 mL完全培养基，继续37℃培养16 h～24 h后，收集培养上清，3500 r/min，离心10 min，0.2μm 滤器过滤，采用实时定量PCR和间接免疫荧光法检测感染性，分装，待用。

（二）稳定过表达GV166－CLEC4M的 Huh7.5细胞系的建立 GV166－CLEC4M慢病毒载体的构建相关方法参见文献［6］。用制备好的GV166－CLEC4M和GV166－空载体共同转染 Huh7.5细胞。转染前12 h～24 h按1.5×105个/孔将 Huh7.5细胞接种到6孔培养板；当细胞融合达30%～50%后，去除培养液，加入 MOI为50的稀释后的GV166－CLEC4M 和GV166－空载体病毒液1 mL，同时加入Polybrene，终浓度为8 mg/L，37℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度培养箱培养。转染后8 h去除含有病毒的培养基，加入新鲜的完全培养基，置37℃、体积分数为0.05的CO2的饱和湿度培养箱培养。转染后24 h，加入G418（600μg/mL）进行筛选。筛选3 d后换液，将G418浓度调整为600 ng/mL 和300μg/mL；培养7 d，换完全培养基于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱培 养，分 别 命 名 为 Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166。

（三）Western印迹和RT－PCR检测Huh7.5细胞上GV166－CLEC4M的表达 Western印迹方法以GAPDH为内参照物，分别提取原始Huh7.5细胞、Huh7.5－CLEC4M细胞蛋白，用BCA测定试剂盒取上清测蛋白浓度，每个样本蛋白终浓度调整为2μg/μL，－80℃保存备用。3种蛋白各取2.0g样品蛋白经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉的封闭液，室温封闭2 h。加入1∶100抗CLEC4M一抗，1∶5 000的GAPDH，4℃孵育过夜，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。加入二抗室温孵育2 h，TBS/T洗膜，共3次，每次5 min。封口，压片，显 影 后 读 片。RT－PCR 检 测：参 照CLEC4M（Genbank注册号为NM－014257）核苷酸序列，上游引物：5′－AATTCCGTGGTGTTGTCG－3′；下游 引 物：5′－AAGGTCCGCTGGATTGAG－3′。 提 取Huh7.5－CLEC4M、Huh7.5－GV166，原始 Huh7.5细胞的总RNA，RevertAiD反转录试剂盒合成cDNA第一链，加入CLEC4M上游及下游引物，以cDNA为模板进行扩增。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸5 min，40个循环，72℃10 min。RT－PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳。

（四）CLEC4M表达与HCVcc结合实验及竞争抑制实验 结合实验中，细胞共分为3组，阳性对照组：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；阴性对照组：Huh7.5－GV166＋ HCVcc病毒液；空白对照组：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。竞争抑制实验：细胞共分为4组，阳性对照组：Huh7.5－CLEC4M＋HCVcc病毒液；单克隆抗体干扰组：Huh7.5－CLEC4M＋鼠抗人CLEC4M单克隆抗体＋HCVcc病毒液；甘露聚糖干扰组：Huh7.5－CLEC4M＋甘露聚糖＋HCVcc病毒液。空白组对照组：Huh7.5－CLEC4M＋5%DMEM。干扰组在加入HCVcc病毒液前，分别加入鼠抗人CLEC4M单克隆抗体和甘露聚糖进行干预，其余两组加入同体积的PBS。

（五）免疫荧光检测CLEC4M对HCVcc的易感性的影响 感染48 h后取出12孔板中提前放置的盖玻片，放入4%多聚甲醛固定，4℃，30 min，PBS漂洗3遍，每次3～5min，然后过 ddH2O。加入0.2%TrionX－100室温透化10 min，PBS漂洗3遍，每次5 min，过ddH2O。37℃，5%BSA溶液封闭1 h，PBS漂洗3遍，每次5 min，过ddH2O。加入HCV NS5a抗体，4℃，过夜。加入Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG，37℃ 湿育1 h，PBS漂洗漂洗5遍，每次5 min，过ddH2O。50%甘油封片后，在荧光显微镜下观察、拍照。

（六）实时PCR 加入病毒液继续培养24 h后，洗净未结合的病毒，换取新鲜的培养基，继续培养，分别收集24 h上清液，进行荧光定量PCR，检测感染细胞的HCV RNA含量。

三、统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、过表达GV166－CLEC4M 的 Huh7.5细胞的检测

（一）Western印迹检测 Huh7.5－CLEC4M 的表达 经检测稳定过表达GV166－CLEC4M的Huh7.5细胞，可在相对分子质量为46×103处有特征性条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合。而原始Huh7.5细胞未见特征性条带（图1）。说明经转染后Huh7.5细胞稳定过表达GV166－CLEC4M。

（二 ）RT－PCR 检 测 Huh7.5 细 胞 上 GV166－CLEC4M的表达

提取各类细胞总RNA，经RT－PCR检测，过表达CLEC4M的Huh7.5细胞在1 200 bp可见明显条带，而空载体和原始Huh7.5细胞在此位置未见条带。说明转染后的Huh7.5可以过表达CLEC4M（图2）。

二、免疫荧光检测CLEC4M对HCVcc的易感性的影响

间接免疫荧光染色后，阳性对照组的荧光强度明显强于单克隆抗体干扰组和甘露聚糖干扰组。空白对照组未见黄绿色荧光（图3）。

图1 Western印迹检测Huh7.5－CLEC4M表达

图2 RT－PCR检测 Huh7.5细胞 GV166－CLEC4M

图3 CLEC4M对HCVcc的易感性影响的免疫荧光结果（×50）

三、RT－PCR

各组细胞经最后一次清洗液RT－PCR检测结果为阴性，说明已将未结合的HCV洗脱，排除了未结合的HCVcc造成的影响。荧光定量PCR检测HCV RNA水平，结果显示，阳性对照组比阴性对照组HCVcc易感性明显增强。阳性对照组和阴性对照组与空白对照组相比，对HCVcc易感性差异有统计学意义（图4）。竞争抑制实验中，阳性对照组HCVcc易感性明显增高，单克隆抗体干扰组和甘露聚糖干扰组与阳性对照组相比，其对HCVcc易感性较低。而各组水平均较空白对照组高（图5）。

图4 CLEC4M表达与HCVcc结合实验荧光定量PCR结果

图5 CLEC4M表达与HCVcc竞争抑制实验荧光定量PCR结果

讨 论

C型凝集素CLEC4M（又称DC－SIGNR），是一种外源C型植物凝素的Ⅱ型跨膜蛋白，与DC－SIGN具有同源的基因及蛋白结构，由7个外显子、6个内含子组成［7］。与DC－SIGN不同的是，CLEC4M 专一地、大量地选择性表达于成熟和未成熟的肝窦内皮细胞、淋巴窦内皮细胞及胎盘毛细血管［8－9］。胞外区C端包含一个糖基结合位点，可通过钙离子依赖方式与病毒糖基结合，其N末端相连高甘露糖寡糖，通过高甘露糖寡糖对sE2有高度亲和力。其天然配体为ICAM－3，主要表达于T淋巴细胞上，加工提呈的抗原可以被大量的T淋巴细胞受体所识别，为早期与CLEC4M的相互作用奠定了基础［10］。

HCV入胞是一个多因素参与的复杂过程，需要多种分子介导或参与，包括 CD81、SR－BI、CLDN1、Occludin、DC－SIGN和LDLR等。CD81和SR－BI目前已经被证明是HCV感染细胞的不可或缺的细胞受体［11］。近期研究表明，C型凝集素CLEC4M有可能介导HCV入胞过程。我们在前期研究中，从外周血中分离出CD14＋细胞，应用IL－4，GM－CSF刺激诱导出成熟DC细胞，运用HCV RNA阳性患者血清感染DC细胞，并设置单克隆抗体和甘露聚糖干扰组的竞争抑制实验。研究显示，经单克隆抗体干扰组和甘露聚糖干扰组的细胞感染效率明显低于阳性对照组，说明CLEC4M可能在HCV感染过程中扮演着重要角色［12］。

近年来，慢病毒载体因其具有宿主范围广、转基因效率高且安全性好等突出优势而在基础和临床研究中得到广泛应用［13］。与其他病毒载体相比，慢病毒不仅具有能够转染分裂期和非分裂期细胞，并稳定表达治疗基因、无明显免疫反应等特性，而且可以广泛转染组织，病毒液浓缩成高滴度。

因此，基于Huh7.5细胞可以同时表达CD81和SR－BI，而不表达 CLEC4M 分子，构 建 了 过 表 达CLEC4M慢病毒载体并转染Huh7.5细胞。转染的Huh7.5细胞经过G418筛选后获得稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞系。HCVcc感染稳定过表达CLEC4M的Huh7.5细胞和空载体细胞，研究结果显示过表达CLEC4M的Huh7.5细胞的感染效率高于空载体组。应用单克隆抗体和甘露聚糖干扰，进行竞争抑制实验。研究发现，阳性对照组的HCV RNA明显高于单克隆抗体干扰组和甘露聚糖干扰组，而单克隆抗体干扰组与甘露聚糖干扰组差异无统计学意义。

本研究显示，CLEC4M在HCV入胞过程中扮演着重要角色。DC是功能强大的专职抗原递呈细胞［14］。成熟DC表面可以高表达CLEC4M，因此，推测CLEC4M分子是DC能够逃逸HCV免疫机制的重要原因，更深层的意义是为临床及基础工作在慢性丙型肝炎治疗提供新的思路，为预防性疫苗的研究提供理论依据［15］。

1 Kohli A，Shaffer A，Sherman A，et al.Treatment of hepatitis C：a systematic review.JAMA，2014，312：631－640.

2 高禄化，聂青和.CLEC4L介导丙型肝炎病毒感染人胎盘滋养层细胞的作用机制.临床肝胆病杂志，2012，28：941－944.

3 Zhang F，Ren S，Zuo Y.DC－SIGN，DC－SIGNR and LSECtin：C－type lectins for infection.Int Rev Immunol，2014，33：54－66.

4 Zhao LJ，Wang W，Ren H，et al.Interaction of L－SIGN with hepatitis C virus envelope protein E2 up－regulates Raf－MEK－ERK pathway.Cell Biochem Biophys，2013，66：589－597.

5 Lindenbach BD1，Evans MJ，Syder AJ，et al.Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.Science，2005，309：623－626.

6 王媛媛，聂青和，朱婷.CLEC4M慢病毒载体的构建及其在K－562细胞中的表达.临床肝胆病杂志，2014，30：518－521.

7 王媛媛，聂青和，高禄化.CLEC4M与丙型肝炎病毒感染的研究进展.肝脏，2012，17：426－429.

8 Khoo US，Chan KY，Chan VS，et al.DC－SIGN and L－SIGN：the SIGNs for infection.J Mol Med（Berl），2008，86：861－874.

9 高禄化，聂青和，王媛媛.CLEC4L在人胎盘组织及滋养层细胞的分布与定位研究.肝脏，2012，17：636－639.

10 Chen PC，Chuang PK，Chen CH，et al.Role of N－linked glycans in the interactions of recombinant HCV envelope glycoproteins with cellular receptors.ACS Chem Biol，2014，9：1437－1443.

11 Samreen B，Khaliq S，Ashfaq UA，et al.Hepatitis C virus entry：role of host and viral factors.Infect Genet Evol，2012，12：1699－709.

12 王媛媛，聂青和，高禄化.CLEC4M介导HCV感染人PBDCs实验研究.肝脏，2013，18：231－234.

13 Rothe M，Modlich U，Schambach A.Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy.Curr Gene Ther，2013，13：453－468.

14 Li J，Feng ZH，Nie QH，et al.Expression of dendritic cell－specific intercellular adhesion molecule 3 grabbing nonintegrin on dendritic cells generated from human peripheral blood monocytes.World J Gastroenterol，2006，12：453－456.

15 Park CG.Vaccine strategies utilizing C－type lectin receptors on dendritic cells in vivo.Clin Exp Vaccine Res，2014，3：149－154.