深海鱼油分子光谱分析研究

方惠敏

(安徽大学现代实验技术中心 ,合肥 230039)

深海鱼油分子光谱分析研究

方惠敏

(安徽大学现代实验技术中心 ,合肥 230039)

应用分子光谱法分析检测深海鱼油，建立了一种鉴定、鉴别深海鱼油新的测定方法。采用二维、三维荧光光谱法结合紫外-可见吸收光谱及其一阶导数图谱进行分析测定, 鱼油图谱差异明显，指纹特征显著。本方法可以快速、准确鉴定深海鱼油的品种品质及其稳定性，重复性好，可为深海鱼油的质量控制提供参考依据。

深海鱼油 荧光指纹图谱 紫外-可见吸收光谱及其一阶导数光谱

1 前言

鱼油是从深海中鱼类动物体中提炼出来的不饱和脂肪(Omega-3)，它是人体必需从外界摄入补充的健康脂肪酸，Omega-3不饱和脂肪酸主要包含EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)两种成分，EPA是有5个双键的多元不饱和脂肪酸，DHA是有6个双键的多元不饱和脂肪酸，属于鱼脂类。DHA可以降低人体血液中的低密度脂蛋白胆固醇，减少血液的粘稠度，防止血液斑块的形成，畅通血管减少心肌梗塞、脑血栓、脑梗赛、中风等心脑血管疾病；DHA健脑益智，是大脑细胞形成、发育及运作不可缺少的物质基础，可以促进、协调神经回路的传导作用，以维持脑部细胞的正常运作。

鱼油产品的质量千差万别，不能只关注EPA和DHA脂肪酸含量最高的产品，鱼油质量最关键的衡量标准是它的纯度和稳定性。稳定性是指鱼油的易氧化程度，DHA和EPA其烯键即碳碳双键化学结构很不稳定，容易被氧化，致使鱼油可储藏性低。氧化来源于高温、光线照射、长时间暴露在空气中以及加工过程中的金属离子，这些都有可能导致其氧化分解。如果鱼油氧化严重，则会造成油质腐化，鱼油中的自由基将会攻击体内细胞，而不是改善细胞功能预防心血管疾病。鱼油被氧化的产物如果长期服用还可能导致急性白血病，后果非常严重，所以稳定性是鱼油质量的另一个关键标准，建立分子光谱分析研究鱼油的新方法非常必要。

由于荧光光谱特别是三维荧光等高线图具有指纹性[1]，能够比较完整地表达研究体系的荧光信息，利用荧光光谱结合紫外-可见吸收光谱可完整显示不同品牌鱼油的品质特征、差异的以及不同存贮时间同种鱼油稳定性的变化规律，本实验提供的分子光谱研究方法能凸出光谱间的差异[2],谱图指纹特征明显，直观易分辨 ，为深海鱼油的质量控制、为鉴别假冒伪劣产品，提供了可供参考的科学依据。

荧光光谱法具有灵敏度高，选择性好等优点，正日益成为分析方法中研究的热点。

2 实验部分

2.1 仪器及样品材料

F-4500荧光分光光度计(日本日立公司)；U-4100紫外-可见、近红外分光光统计(日本日立公司)。

某品牌深海鱼油:A鱼油 (处在保质期内的鱼油样本),同一品牌B鱼油 (超过保质期的鱼油样本)，产地为中国；C品牌深海鱼油样本(保质期内)，产地美国；D品牌深海鱼油样本(保质期内)，产地加拿大。以上深海鱼油均为市售。

2.2 实验方法

分别取出A、B、C、D 4种等量鱼油软胶囊，用针刺破，将其内容物分别倒入石英样品液池中，置于仪器的样品池架内，分别检测4种样品的荧光发射光谱(二维、三维)、 荧光激发光谱、紫外-可见吸收光谱及其一阶导数光谱。

2.2.1 二维荧光光谱测定

实验条件：激发测和发射测带宽均为5nm，响应8s，光电倍增管电压700V，扫描速度240nm/min。

A鱼油：分别设定λem=512nm，λex=413nm，测其荧光激发光谱、荧光发射光谱(图1、图2)；

B鱼油：分别设定λem=542nm，λex=453nm，分别测其激发和发射光谱(图3、图4)；

C鱼油：分别设定λem=521nm，λex=440nm，分别测其激发和发射光谱(图5、图6)；

D鱼油：分别设定λem= 506 nm，λex =411nm，测其激发和发射光谱(图7、图8)；

图1 A鱼油激发光谱

图2 A鱼油荧光光谱

图3 B鱼油激发光谱

图4 B鱼油荧光光谱

图5 C鱼油激发光谱

图6 C鱼油荧光光谱

图7 D鱼油激发光谱

图8 D鱼油荧光光谱

比较谱图间差异性，观察特征峰位置及强弱，谱图形状。

2.2.2 三维荧光光谱测定

实验条件：激发测和发射测带宽2.5nm、5.0nm，响应0.1s，采样间隔5nm，光电倍增管电压700V，扫描速度12000nm/min。分别进行A、B、C、D四种鱼油的3D图谱测量。测量结果见图9、10、 11、 12，比较分析图谱的形状，主峰峰位、峰强等。

图9 A鱼油3D图谱

图10 B鱼油3D图谱

图11 C鱼油3D图谱

图12 D鱼油3D图谱

2.2.3 紫外-可见吸收光谱及其一阶导数光谱的测定

实验条件：光栅狭缝宽度2.0nm，扫描速度600nm/min，采样间隔2.0nm，光电倍增管电压自动，灯切换模式自动。分别进行A、C、D三类鱼油吸收光谱测定(图13、14、15)及其一阶导数谱图的测定(图16、17、18)。比较分析峰位、谷的位置，图谱峰的吸光度，谱图形状差异等信息。

图13 A鱼油紫外吸收图谱

图14 C鱼油紫外吸收图谱

图15 D鱼油紫外吸收图谱

图16 A鱼油一阶导数图谱

图17 C鱼油一阶导数图谱

图18 D鱼油一阶导数图谱

3 结果与讨论

3.1 深海鱼油稳定性变化规律

大多数能产生荧光的物质都含有π→π*跃迁的刚性共轭体系,分子中C=C-C=C单、双键交替的共轭结构，其中π电子能吸收光子而产生荧光效应，特征波长λex/λem处的荧光强度和位置可作为定性分析的依据[1]。对于同一品牌A鱼油(处在保质期内的样本)和B鱼油(超过保质期的过期鱼油样本即存放时间较长的样本)，在相同测量条件下比较图1和图3，图2和图4，可得A鱼油的荧光特征波长为λex/λem=413nm/512nm，B鱼油的荧光特征波长为λex/λem=453nm/542nm；A鱼油荧光强度较B鱼油弱。比较A和B三维荧光等高线光谱图图9和10，图中纵坐标为激发波长λex，横坐标为发射波长λem，等高线表示荧光强度。A和B的3D图均显示出1个明显的荧光峰，两者特征峰峰位A鱼油：λex/λem=400nm/495nm，B鱼油：λex/λem=450nm/535nm；B鱼油等高线光谱较A鱼油密集，即荧光强度变强。检测结果显示，虽是同一种鱼油但随着存放时间的延长，2D和3D谱中，它们的特征波长都将发生改变，峰值波长均发生了红移，而荧光强度在逐渐增加。

鱼油会发射出蓝色荧光，该荧光是由鱼油中的脂肪吸收紫外光而发射出，而且随着鱼油存放时间的增加，鱼油中的脂肪会逐渐氧化而导致其荧光发生红移，强度逐渐增加。若发生氧化聚合，聚合物明显增加，会使鱼油粘度增大，色度加深，鱼油品质进一步变化，鱼油荧光的变化反映了物质中分子本身及周围环境的变化。

3.2 不同品牌深海鱼油的检测

3.2.1 二维荧光光谱的比较

比较A、C、D 3种鱼油的二维荧光光谱(图2、6、8)、 激发光谱(图1、5、7)，三者荧光特征波长位置和强度存在差异而不同，A鱼油：λem=512nm，C 鱼油：λem=521nm，D鱼油：λem=506nm ;C 鱼油荧光强度最弱。

它们的激发光谱形状、峰位、强度均不相同。C鱼油激发光谱呈现多峰图谱,A鱼油、D鱼油均呈现单峰谱图，最佳激发波长均不同，分别是A：λex=413nm，C：λex=440nm，D：λex=411nm ，C 鱼油强度最弱。

3.2.2 三维图谱的比较

比较A、C、D 3种鱼油的三维图谱( 图9、11、12) A鱼油等高线图谱显示为单峰指纹图，峰位λex/λem=400nm/495nm；C鱼油为多峰指纹图，含三个特征峰，λex/λem=425nm/500nm，λex/λem=400nm/485nm，λex/λem=375nm/480nm；D鱼油为单峰指纹图，峰位λex/λem=405nm/490nm 。它们峰位各不相同；等高线光谱密集度不同，显示荧光强度的差异。

三维荧光等高线光谱图很像人的指纹，是一种形象的指纹图[1]。 每一种物质都有一定的化学组成，具有特征的三维荧光指纹图谱，通过比较三维荧光图谱的形状、荧光峰的位置和荧光强度可以对物质进行品质、真伪的鉴别、评价。三维荧光光谱能够获得在激发波长和发射波长同时改变情况下的荧光强度，可完整表达研究物质的光谱信息，更具备指纹性。

3.2.3 紫外-可见吸收光谱及其一阶导数图谱的比较

比较A、C、D 3种鱼油的紫外-可见吸收光谱及其一阶导数图谱，观察3种鱼油紫外吸收谱图(图13、14、15)，紫外吸收峰峰位，峰形均不同。由于鱼油具有共轭双键的分子结构，这种共轭体系分子电子吸收光波能量产生π→π*跃迁，依据紫外吸收峰的位置和强度变化，可做为检验、鉴定方法[3]。

3种鱼油导数谱图( 图16、17、18)，谱图之间存在差异明显。通过比较可知，导数谱图能减少峰形之间的叠加和干扰，分离重叠的吸收峰，增强特征光谱精细结构的分辨力，区分光谱的细微变化，导数技术可提高谱图的分辨率，因此一阶导数图比常规二维谱图更具指纹性，是一种较好的鱼油鉴定谱图。

3.2.4 谱图差异的本质

影响荧光的外部因素: 分子结构和化学环境是影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素。

分子所处的外界环境，如溶剂的性质、体系的pH 、取代基、金属离子等都会影响荧光效率，甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧光光谱和荧光强度。

溶剂的影响: 同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有增强。这是因为在极性溶剂中，π→π*跃迁需要的能量差ΔE小，而且跃迁概率增加，使紫外吸收和荧光波长均向长移，强度也增强；溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱,故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。

pH的影响: 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH对该荧光物质的荧光强度有较大的影响，这主要是因为弱酸弱碱和它们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度也有差异。在每一种荧光物质都有其适宜的发射荧光的存在形式，也就有相应的pH范围，以保持荧光物质和溶剂之间的离解平衡；

荧光分子与其他分子之间相互作用：取代基性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响，会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。通常给电子基团如-NH2、-OH 、-OCH3、-NHCH3和-N( CH3)2等使荧光增强。吸电子基团如-CL、-Br、-l、-NHCOCH3、-NO2、-COOH等使荧光减弱; 大多数无机盐类金属离子不产生荧光，而某些情况下金属鳌合物却能产生很强的荧光。

提炼深海鱼油的原料来源主要有以下4种：野生三文鱼、人工三文鱼(化学合成)、杂鱼(如柴鱼、沙丁鱼 )、杂鱼加豆油。不同来源的鱼油，单就多不胞和脂肪酸组成会不一样，含量亦不同，另外可能含有添加剂、杂质等，导致不同品牌的鱼油质量就会有差别，光谱指纹图存在差异，不同品牌鱼油呈现出不同的指纹谱图特征，从而达到鉴别，鉴定的目的。

3.2.5 光谱的稳定性和重现性

为了考察样品光谱的稳定性和重复性，分别进行了平行样测定，平行样之间的光谱峰位置确定，强度稳定，相对标准偏差小，表示出良好的重现性和稳定性。 每种鱼油又进行另一批产品的检测，检测结果一致、稳定。

4 结论

深海鱼油中不饱和脂肪酸成份的相对组成的差异，环境污染残留物，有害杂质的存在及鱼油的氧化变化，使不同鱼油、不同状态鱼油呈现具有特征性的指纹光谱图。荧光光谱技术能够很好地反映深海鱼油组成的信息变化，利用荧光及一些紫外光谱参数[4]等光谱手段多角度地、全面分析和探讨，可对鱼油进行定性分析。具有特征性的指纹图谱，可以迅速鉴别不同品牌的深海鱼油亦可进行鱼油的稳定性、新鲜度的检测，达到进行质量控制的目的。检测结果具有良好地重现性，分子光谱研究扩展了深海鱼油鉴别的分析方法和手段。光谱技术可反映扫描对象结构和化学成份及含量的差异，灵敏度高，选择性强，与利用其它处理、识别方法相比，光谱分析的识别处理方法简单、迅速，这些优势，将光谱技术应用于物质的鉴定、识别是可行而重要的研究方向。

[1]许金钩，王尊夲.荧光分析法.3版.北京：科学出版社，2006：137，154.

[2]胡春明，张远. 太湖典型湖区水体溶解有机质的光谱学特性.光谱学与光谱分析，2011，31(11)：3022.

[3] 纳鹏军，晋晓勇.煎炸胡麻油分子光谱分析研究.光谱学与光谱分析，2011，31(7)：1889.

[4]刘东辉，刘翠玲.薄荷药材HPLC特征图谱分析方法研究.药物分析杂志，2010，30(8)：1507.

Determination of fish oil by molecular spectrum.

Fang Huimin

(ExperimentandTechnologyCenter,AnhuiUniversity,Hefei230039,China)

A method for determination of fish oil using molecular spectrum was developed. Two dimensional fluorescence, three dimensional fluorescence and UV spectroscopy were used for analyzing, identifying the fish oil. The difference between the spectra of fish oil can be clearly identified,and the characteristics of fingerprint patterns are obviously exhibited. It provides a scientific reference for the quality control of the fish oil.

fish oil; fluorescence fingerprint; UV-Vis absorption spectra and first-order derivative spectra

方惠敏， 实验师，主要从事仪器分析实验教学及相关的科研分析检测工作，E-mail:hui-min@ahu.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2015.04.005

2015-03-23