电针内关穴预处理对兔心肌缺血再灌注CK及心肌细胞活性的影响

王超,张佳丽,刘昭,刘密,严洁,常小荣,郭礼娜,艾坤(湖南中医药大学,长沙 410007)

电针内关穴预处理对兔心肌缺血再灌注CK及心肌细胞活性的影响

王超,张佳丽,刘昭,刘密,严洁,常小荣,郭礼娜,艾坤(湖南中医药大学,长沙 410007)

目的观察电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤兔CK及心肌细胞活性的影响,为证实心包经穴位与心之间的相对特异性联系提供实验依据。方法将40只新西兰大耳白兔随机分为A组、B组、C组、D组和E组,每组8只。A组为假手术组;B组为缺血再灌注模型组,于左冠状动脉前降支阻断冠脉30 min,再灌注60 min;C组、D组和E组在造模前7 d,每日分别取内关、列缺及合谷给予电针刺激20 min。比较各组肌酸激酶(CK)及心肌formazan含量变化。结果B组、C组、D组和E组血清CK及心肌formazan含量与A组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)。C组、D组和E组血清CK含量与B组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。C组心肌formazan含量与B组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。D组和E组血清CK 及心肌formazan含量与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05)。结论电针内关穴能减轻心肌缺血再灌注对心肌细胞的损伤,从而对心脏产生保护作用。

针刺疗法;电针;心肌再灌注损伤;肌酸激酶;心肌细胞活性;穴,内关;穴,列缺;穴,合谷;兔

缺血性心脏病是冠状动脉血流减少而引起心肌缺血、缺氧,甚至坏死而导致心脏病,而改善心肌缺血的方法是恢复灌流,但近年来研究表明恢复灌流仍能造成心肌细胞进一步的损伤,即心肌缺血再灌注损伤,防治心肌缺血再灌注损伤已成为冠心病治疗亟待解决的关键问题之一[1]。针灸作为一种安全而疗效独特的治疗手段,正在被广泛地应用于临床。大量研究表明,针灸有利于改善心肌缺血再灌注损伤[2-3]。本实验主要通过观察电针预处理不同经穴对兔心肌缺血再灌注损伤血清CK和细胞活性物质的影响,来证实心包经穴位与心之间的相对特异性联系,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级新西兰大耳白兔40只,雌雄各半,体重为1.5～2.5 kg,饲养温度为20℃～25℃,月龄为3～4个月,由湖南中医药大学动物实验中心提供。常规饲养7 d后,随机分为A组、B组、C组、D组和E组,每组8只。

1.2 造模方法

参照万丽丽等[4]方法,兔耳缘静脉注射20%乌拉坦(4 mL/kg)作全身麻醉。颈部去毛,行气管切开术,接动物人工呼吸机。沿胸骨正中线左侧旁开1～2 cm处切开皮肤,暴露心脏,轻轻剪开心包膜,提起左心耳,在左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿一根零号医用缝合线,并置1根硅胶管结扎血管,立即监测心电图,若结扎前心电图异常,则退出实验。缺血标志以左心室前壁发绀及心电图ST段抬高为准则。关闭胸腔,缺血30 min后开胸,松开硅胶管,恢复左前降支灌流60 min。在造模过程中,结扎冠状动脉失败或未发生灌注或中途死亡则视为造模失败,共有12只动物退出实验。

1.3 实验方法

1.3.1 A组

常规饲养7 d,开胸,左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线不结扎,90 min后摘取心脏。

1.3.2 B组

常规饲养7 d,开胸,左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线,阻断冠脉30 min,再灌注60 min,摘取心脏。

1.3.3 C组

在造模前7 d进行电针治疗,取双侧内关穴。穴位定位参照《实验针灸学》[5]家兔常用针灸穴位图谱,并结合解剖学进行穴位定位。内关定位为前壁下1/6折点处内侧,桡、尺骨间隙中。采用0.25 mm×13 mm毫针直刺3 mm,行提插捻转手法1 min后接苏州医疗用品厂有限公司出品的SDZ-Ⅱ型电子治疗仪,穴位处接负极,正极接兔尾部,采用疏密波,强度以双上肢轻微颤动为度,留针20 min。电针治疗7 d后,开胸,左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线,阻断冠脉30 min,再灌注60 min,摘取心脏。

1.3.4 D组

取列缺穴,采用拟人比照法定位。其余操作方法同C组。

1.3.5 E组

取合谷穴,位于前肢第1、2掌骨之间,其余操作方法同C组。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 肌酸激酶(CK)含量检测

各组在灌流60 min后均采用真空采血管取颈动脉6 mL,分别等量注入空试管及含10%EDTA-Na2和抑肽酶的试管中,离心分离血清和血浆,移液枪分别吸取上清0.5 mL至离心管内,-20℃冰箱冻存,用酶联免疫法检测血清CK含量。

1.4.2 心肌formazan含量检测

将从灌流装置上取下的心脏组织切成薄片(1～2 mm),在37℃水浴中用1.25 g/L的MTT孵育30 min。然后取出心肌片,吸干表面水分并称其湿重,按40 mL/g标准加入二甲基亚砜后匀浆,匀浆液离心(1000×g,10 min),取上清液1 mL在490 nm处测量其吸光度。

1.5 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行处理,各监测指标统计数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD法。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CK含量比较

由表1可见,B组、C组、D组和E组血清CK含量与A组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。C组、D组和E组血清CK含量与B组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。D组和E组血清CK含量与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。

表1 各组血清CK含量比较 (±s,U/L)

表1 各组血清CK含量比较 (±s,U/L)

注:与A组比较1)P＜0.01;与B组比较2)P＜0.01;与C组比较3)P＜0.01

组别 n CK含量A组 8 259.20±8.61 B组 8 2454.10±17.201)C组 8 945.69±9.711)2)D组 8 1870.20±12.141)2)3)E组 8 1909.10±19.151)2)3)

2.2 各组心肌formazan含量比较

由表2可见,B组、C组、D组和E组心肌formazan含量与A组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。C组心肌formazan含量与B组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。D组和E组心肌formazan含量与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组心肌formazan含量比较 (±s)

表2 各组心肌formazan含量比较 (±s)

注:与A组比较1)P＜0.05;与B组比较2)P＜0.05;与C组比较3)P＜0.05

组别 n 490 nm吸光度A组 8 1.20±0.03 B组 8 0.86±0.031)C组 8 1.13±0.021)2)D组 8 0.89±0.021)3)E组 8 0.88±0.031)3)

3 讨论

肌酸激酶通常存在于动物心脏、肌肉等组织的大量细胞浆和线粒体中。在临床上,当心肌梗死发作时,人血清中的肌酸激酶水平迅速提高,因此血清酶的升高可作为心肌受损的酶学标志物。实验研究表明[6],电针内关穴能有效降低家兔急性心肌缺血模型心肌酶的作用,对再次发作的急性心肌缺血有良好的预防和保护作用。

针灸预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞具有保护作用,可通过刺激缺血再灌注大鼠产生更多抗凋亡物质而减少其细胞凋亡,从而有效防治缺血性心脏病的发生[7]。亦有实验证明针刺心俞预处理对凋亡相关蛋白有调整作用,从而实现对心肌细胞的保护[8]。实验研究表明,电针心包经的经穴对心动过缓大鼠的心率与心功能的调节作用优于胃经经穴,表明不同经脉的穴位对心脏功能的调节有相对特异性[9]。根据穴位相近原则,本实验亦选取了列缺与合谷为对照。列缺为手太阴肺经络穴,与内关同为八脉交会穴,通任脉。现代研究发现列缺在一定程度上能改善心肌缺血状况。王欣等[10]实验研究发现,电针肺经“太渊-列缺”经脉段可以显著促进心力环面积的恢复及提高交感神经的兴奋性,从而改善家兔的心功能,对抗急性心肌缺血状态。合谷为手阳明大肠经原穴,有理气活血通络作用,吴松等[11]实验研究表明电针合谷穴可以有效防治心肌肥厚,且优于内关、神门穴,这种保护作用可能与抑制TNF-α等炎症细胞因子的表达有关。内关穴是手厥阴心包经络穴、八脉交会穴之一。《灵枢•邪客》:“心者,五脏六腑之大主也,精神之所舍也,其脏坚固,邪弗能容也……故诸邪之在于心者,皆在于心之包络。”当邪气侵犯时,首先由心包代受,从而减轻心脏受到损害。实验研究表明电针内关穴预处理可以减少心肌梗死范围,降低心肌酶水平,减轻心肌细胞形态结构损伤[12]。同时针灸内关穴预处理可以抑制死亡受体通路Fas/FasL蛋白的表达,从而抑制缺血再灌注后细胞凋亡的发生,由此对心肌细胞发挥延迟相的保护作用[13]。

本实验研究结果表明,与B组相比,C组能显著降低血清CK含量,增加心肌细胞活性,而D组和E组对血清CK含量影响较小,对心肌细胞活性的影响则无统计学意义,表明电针内关预处理能有效改善心肌细胞受损状态,激活心肌细胞活性,而对心脏产生一种保护作用;C组与D组和E组比较,血清CK含量明显下降,而心肌细胞活性物质明显升高,其结果表明,内关穴对心肌缺血再灌注损伤心肌保护作用明显优于手太阴肺经络穴列缺穴以及手阳明大肠经原穴合谷,验证了心包经与心脏联系的相对特异性。针灸预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护机制仍需要进一步阐明。近来研究发现,线粒体通透性转运孔的开放、细胞内钙离子浓度增加、活性氧分子、过量的一氧化氮、内质网应激和非折叠蛋白反应等均可促进心肌细胞的自噬。因此,有必要在本研究基础上进一步探讨针灸预处理对MIRI过程中自噬的调控机制。

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[2] 张江玲,陈杰,王瑞祥,等.电针“内关”穴预处理对缺血再灌注大鼠心肌的保护作用[J].针刺研究,2010,35(3):182-187.

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Effect of Pretreatment with Electroacupuncture at Point Neiguan(PC6) on CK and Myocardial Cell Activity in Rabbit Myocardial Ischemia and Reperfusion

WANG Chao, ZHANG Jia-li, LIU Zhao, LIU Mi, YAN Jie, CHANG Xiao-rong, GUO Li-na, AI Kun. Hunan University of traditional Chinese medicine,Changsha 410007,China

ObjectiveTo investigate the effect of pretreatment with electroacupuncture at point Neiguan(PC6) on CK and myocardial cell activity in rabbit myocardial ischemia-reperfusion injury and provide an experimental basis for a relatively specific relationship between pericardium meridian points and the heart.MethodsForty New Zealand big ear rabbits were randomly allocated to groups A, B, C, D and E, eight rabbits each. Group A was a sham operation group. Group B was an ischemia-reperfusion model group, in which the left anterior descending coronary artery was occlude for 30 min and reperfused for 60 min. In groups C, D and E, points Neiguan(PC6), Lieque(LU7) and Hegu(LI4) were separately given electroacupuncture stimulation, 20 min every day, at seven days before model making. Creatine kinase (CK) and myocardial formazan contents were compared between the groups.ResultsThere were statistically significant differences in serum CK and myocardial formazan contents between group B, C, D or E and group A (P＜0.01, P＜0.05). There was a statistically significant differences in serum CK content between group C, D or E and group B (P＜0.01). There was a statistically significant differences in myocardial formazan content between groups C and B (P＜0.05). There were statistically significant differences in serum CK and myocardial formazan contents between group D or E and group C (P＜0.01, P＜0.05). Conclusion Electroacupuncture at point Neiguan(PC6) can reduce myocardial ischemia-reperfusion induced injury to myocardial cells to produce a protective effect on the heart.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Myocardial reperfusion injury; Creatine kinase; Myocardial cell activity; Point, Neiguan(PC6); Point, Lieque(LU7); Point, Hegu(LI4); Rabbit

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.01.0067

2014-09-23

1005-0957(2015)01-0067-03

国家自然科学基金项目(81072868,81102661);湖南省科技厅课题(2013sk3086)

王超(1974 - ),女,副教授,硕士生导师,E-mail:592436380@ qq.com

严洁(1941 - ),女,教授,博士生导师,E-mail:yj5381159 @126.com