“双固一通”电针法对老年阳虚证模型大鼠肝线粒体结构及ATP酶活性的影响

刘建民,吕景芳,王华,刘静,陈明扬,王静芝

·动物实验·

“双固一通”电针法对老年阳虚证模型大鼠肝线粒体结构及ATP酶活性的影响

刘建民1,吕景芳2,王华1,刘静3,陈明扬4,王静芝1

(1.湖北中医药大学,武汉430061;2.十堰市妇幼保健院,十堰 442000;3.孝感市中心医院,孝感 432000;4. 武汉市中医医院,武汉 430010)

目的探讨“双固一通”电针法对老年阳虚证模型大鼠肝线粒体形态结构及ATP酶活性的影响。方法选用5月龄SD雄性大鼠40只,随机分为A组、B组、C组和D组,每组10只。A组为正常对照组,其余3组大鼠均皮下注射D-半乳糖40 d后再肌肉注射氢化可的松7 d制作老年阳虚证大鼠模型。C组采用“双固一通”电针法,电针关元、足三里、百会穴;D组采用电针中极、阴陵泉、印堂穴治疗。每星期治疗6次,共治疗4星期。治疗后以游泳力竭时间判定各组大鼠抗疲劳能力,并采用透射电镜观察肝线粒体结构、比色法检测各组大鼠肝组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。结果与A组比较,B组和D组大鼠平均游泳力竭时间明显缩短(均P＜0.01),肝线粒体内外膜模糊不清,嵴变形、断裂或消失,肝线粒体出现肿胀等改变,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均下降(P＜0.01,P＜0.05)。C组比B组游泳力竭时间明显延长(P＜0.01),肝线粒体形态结构得到明显改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显提高(P＜0.01,P＜0.05);D组与B组比较,大鼠平均游泳力竭时间缩短(P＜0.05),肝粗面内质网有脱颗粒,肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P＜0.05)。结论“双固一通”电针法可改善老年阳虚证模型大鼠阳虚抗疲劳能力,改善肝线粒体超微结构,提高肝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,促进肝脏能量代谢。

针刺疗法;电针;阳虚证;肝线粒体;ATP酶;“双固一通”电针法;大鼠

阳虚是指机体阳气亏虚及其温煦、推动、兴奋等功能减退而表现为虚寒内生、精神萎靡、活动减少、代谢低下等功能抑制的病理状态[1-2]。近年来,有学者通过对阳虚证的研究表明[3-4],阳虚证与机体能量代谢紊乱密不可分。笔者前期研究表明,“双固一通”电针对老年阳虚证模型大鼠在免疫调控方面以及肝线粒体呼吸功能方面均有显著改善效应[5-6]。本实验探讨“双固一通”电针对老年阳虚证模型大鼠肝线粒体结构及ATP酶活性的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

LKB-V型超薄切片机(瑞典BROMMA公司);日立H-600型透射电镜(日本日立公司);721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);KDC-160HR高速冷冻离心机(上海科大);DH 3600 AB电热恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司);无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);HANS LH202H型电针仪(北京华威有限公司)。

水合氯醛为国产分析纯;ATP酶测试盒(生产批号20120428,南京建成生物工程研究所);考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(Aidlab,北京)。

1.2 实验动物与分组

实验动物为5月龄Sprague Dawley健康雄性大鼠,40只,清洁级,体重为200～230 g,购自武汉大学动物实验中心[许可证号SCXK(鄂)2008-0004]。所有动物饲养于较为恒定的动物饲养室(温度为18℃～25℃,湿度为45%～55%),动物可自由摄食和饮水。根据简单随机排序法随机分为A组、B组、C组和D组,每组10只。

1.3 老年阳虚证模型制作

参考黄兆胜制作阿尔茨海默病肾阳虚模型[7]及课题前期实验中老年阳虚证模型[5]制作,大鼠适应性喂养1星期后,开始造模,除D组外,其余各组大鼠均连续40 d按每鼠每日125 mg/kg D-半乳糖给予颈背部皮下注射,之后连续7 d再行后腿肌肉注射氢化可的松1.5 mg/100 g,D组每日皮下注射等量0.9%生理盐水1次,连续47 d。造模成功后的大鼠出现拱背蜷曲、肢尾冷、挤卧一起,被毛蓬松、失去光泽,足趾浮肿,舌淡胖苔润,神疲、少食、反应迟钝、小便多等虚损状。根据中医阳虚证辨证参考标准[8],类似“阳虚”状态。

1.4 处理方法

1.4.1 A组

正常饲养(以下各组略),不进行造模及电针治疗。

1.4.2 B组

造模,不予电针治疗。

1.4.3 C组

造模成功后,参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》,取关元、足三里和百会。穴区剪毛备皮,75%医用乙醇常规消毒,用0.35 mm×25 mm不锈钢毫针针刺,关元直刺3～5 mm,双侧后三里直刺3～5 mm,百会向后平刺5 mm。其中关元与足三里接HANS LH202H型电针仪,双侧足三里与关元隔日交替接1对电极,选用连续波,频率为2 Hz,强度为1 mA,通电15 min。每日上午9～11时治疗1次,每星期治疗6次,共治疗4星期。

1.4.4 D组

造模完成后第2天,取中极、阴陵泉、印堂进行电针治疗处理,操作方法及疗程同A组。

A组和B组相同方法、相同时间段内抓取固定。各组大鼠治疗及游泳力竭试验结束后,禁食,于第2天取材,进行相应指标检测。

1.5 标本采集与指标检测

1.5.1 游泳力竭试验

各组大鼠于末次治疗后进行游泳力竭试验。采用负重游泳运动方式[9],泳池水深30 cm,水温保持在(26 ±1)℃,每0.2 m2水面同时放4～5只大鼠游泳,游泳时避免大鼠互相抓抱或者趴于池壁休息,当大鼠游泳动作明显不协调,然后沉入水中10 s以上不能浮出时视为力竭。从大鼠入水开始计时,至大鼠力竭停止,记录每只大鼠力竭潜伏时间。

1.5.2 肝脏线粒体超微结构检测

将大鼠腹腔麻醉,颈部脱臼处死,迅速剖开腹腔取出肝组织,剪下约1 mm3肝组织块,放入2.5%戊二醛中固定2 h后送至武汉大学电镜室,透射电镜观察肝脏线粒体超微结构的变化。

1.5.3 肝组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性检测

另取肝组织块约0.5 g,分成若干份,在预冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干。将肝组织块称重后置于匀浆器中,按1:9的比例加入0.9%的冷生理盐水制成10%的匀浆液。将制备好的组织匀浆液转入离心管,置冷冻离心机,4℃以2000 r/min离心15 min。取上清液装入样品管中-20℃冷藏备用。肝组织蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法。具体操作按各试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

所有实验数据使用SPSS 13.0软件进行统计学处理,计量资料用均数±标准差表示,采用方差齐性检验和单因素方差分析,组间比较采用q检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠平均游泳力竭时间比较

由表1可见,B组和D组大鼠平均游泳力竭较A组明显缩短(P＜0.01);经“双固一通”电针处理的C组大鼠平均游泳力竭时间与B组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01);而D组游泳力竭时间虽较B组延长,但与C组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠平均游泳力竭时间比较 (±s,min)

表1 各组大鼠平均游泳力竭时间比较 (±s,min)

注:与A组比较1)P＜0.01;与B组比较2)P＜0.01;与C组比较3)P＜0.05

组别 n 平均游泳力竭时间A组 10 94.64±6.31 B组 10 67.72±7.211)C组 10 88.27±7.602)D组 10 76.49±6.591)3)

2.2 电镜观察肝脏线粒体超微结构的变化

各组大鼠肝脏线粒体超微结构见图1。A组线粒体内外膜清晰,线粒体嵴完整可见(图1-1),粗面内质网丰富且无脱颗粒现象(图1-2)。B组线粒体内外膜模糊不清,嵴变形、断裂或消失,线粒体出现肿胀融合等改变(图2-1),粗面内质网减少(图2-2)。C组线粒体数目较B组增多,形态结构完整,膜清晰,嵴完整(图3-1),粗面内质网无明显改变(图3-2)。D组线粒体形态清楚(图4-1),但粗面内质网有脱颗粒(图4-2)。

图1 各组大鼠肝脏线粒体超微结构示意图

2.3 各组大鼠肝组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较

采用定磷法按照ATP酶试剂盒说明书检测大鼠肝组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,ATP酶活性以每小时每毫克蛋白分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位表示,即μmolPi/mgprot/h。计算公示为,ATP酶活性＝[(测定管吸光度－空白管吸光度)/标准管吸光度]×标准浓度(1 μmol/mL) ×[(样本稀释倍数×6)/蛋白浓度]。

由表2可见,A组大鼠Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显低于B组(P＜0.05,P＜0.01)。与B组比较,C组Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显提高,两组相比较差异均具有统计学意义(P＜0.05, P＜0.01)。D组Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均低于C组,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠肝组织Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

3 讨论

肝脏是能量代谢的重要器官,线粒体是细胞氧化磷酸化产生ATP以供能的主要场所。Na+-K+-ATP酶是维持线粒体膜水钠平衡的关键物质,Ca2+-Mg2+-ATP酶是维持细胞内钙镁平衡的重要物质,其生理作用均需通过分解ATP来实现[10],ATP酶活性是衡量线粒体能量代谢及功能有无损伤的重要指标。研究表明[11-12],细胞内Ca2+的超载与机体的老年性疾病密切相关,而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性是Ca2+分布的基础,线粒体的结构破坏与功能抑制,将使老年机体处于代谢紊乱状态[13]。老年阳虚者畏寒怕冷、疲乏无力、多种代谢功能低下,与肝脏线粒体功能低下密切相关。为了从行为学方面反映电针对阳虚证的改善效果,在实验中借鉴以往研究[14]引入游泳力竭试验,结果表明,老年阳虚模型大鼠平均游泳力竭时间较正常对照组明显增加(P＜0.01);而通过“双固一通”电针治疗能明显延长大鼠游泳力竭时间(P＜0.01),提示“双固一通”电针能改善老年阳虚模型大鼠阳虚症状。电镜观察发现,老年阳虚证模型大鼠肝线粒体内外膜模糊不清,嵴变形、断裂或消失,线粒体肿胀融合;采用定磷法检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显降低,表明机体处于阳虚供能不足、能量代谢低下状态。经“双固一通”电针治疗后大鼠线粒体形态结构得到改善,Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均明显升高。提示“双固一通”电针法能改善肝细胞受损状态,促进ATP合成与分解,使肝细胞处于能量代谢活跃状态。

《灵枢•天年》:“五十岁,肝气始衰,肝叶始薄,胆汁始减,目始不明。六十岁,心气始衰,苦忧悲,血气懈堕,故好卧。七十岁,脾气虚,皮肤枯。八十岁,肺气衰,魄离,故言善误。九十岁,肾气焦,四藏经脉空虚。”强调人体衰老始于肝,根于脾肾,机体衰老与脏腑功能减退密切相关。中医学理论认为肾藏先天之精,是生命之本源,为人体先天之本。脾主运化水谷精微,化生气血,为人体后天之本。肝藏血,主疏泄,精血皆由水谷精微所化生和充养,肝肾同源而藏泄互用。老年阳虚者表现为机体阳气不足,虚寒内生,温煦推动功能减退,其主要原因可归纳为肾气亏虚,脾胃虚弱,肝阳虚衰,肝失疏泄,气血运行不畅。本实验选用具有固护先天的关元、固护后天的足三里和益气安神的百会,是基于“双固一通”针法[15]而来,针灸“治未病”以正气为本,固护先天和后天是其基础和关键,这为“双固一通”电针法防治阳虚衰老提供了理论指导。足三里为足阳明胃经合穴,具有健脾益胃、补益气血、强壮机体的作用;关元位于任脉,具有补肾壮阳、延年益寿之效;百会归属督脉,与手足少阳、足太阳、足厥阴经相交会,故又称三阳五会,其穴居巅顶,内络于脑,补之能益气升阳,宁心安神。以往研究多从神经内分泌免疫抗衰老、抗自由基氧化等方面研究关元、足三里、百会穴对老年机体延缓衰老的作用机制[16-17],而从肝能量代谢方面对老年阳虚证的探讨较少。

为了探讨“双固一通”配穴电针治疗对老年阳虚证肝脏能量代谢作用是否具有优势,实验同时选取关元、足三里、百会各穴邻近穴位(中极、阴陵泉、印堂)作为对照电针治疗,结果表明,“双固一通”电针对老年阳虚模型大鼠阳虚改善、肝线粒体超微结构改善及ATP酶活性的提高能力均优于中极、阴陵泉、印堂的治疗效果。

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Effect of “Double Reinforcing and One Unblocking” Electroacupuncture on Hepatic Mitochondrial Structure and ATPase Activity in a Rat Model of Senile Yang Deficiency

LIU Jian-min1, LV Jing-fang2, WANG Hua1, LIU Jing3, CHEN Ming-yang4, WANG Jing-zhi1. 1.Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China; 2.Shiyan Maternal and Child Health Hospital,Shiyan 442000,China; 3.Xiaogan Central Hospital,Xiaogan 432000,China; 4.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430010,China

ObjectiveTo explore the effect of “double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture on hepatic mitochondrial structure and ATPase activity in a rat model of senile yang deficiency.MethodsForty 5-month-old male SD rats were selected and randomly allocated to groups A, B, C and D, 10 rats each. Group A was a normal control group. A model of senile yang deficiency was made by 40 days’ subdermal injection of D-galactose and then 7 days’ intramuscular injection of hydrocortisone in the other three groups of rats. Group C received treatment with “double reinforcing and one unblocking”electroacupuncture at points Guangyuan(CV4), Zusanli(ST36) and Baihui(GV20); group D, treatment with electroacupuncture at points Zhongji(CV3), Yinlingquan(SP9) and Yintang(GV29). Treatment was given 6 times a week for a total of 4 weeks. After treatment, the anti-fatigue ability was determined by swimming exhaustion time, hepatic mitochondrial structure was observed under a transmission electron microscope and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities were measured by colorimetry in every group of rats.ResultsThe mean swimming exhaustion time shortened significantly (all P＜0.01); hepatic mitochondrial inner and outer membranes were blurred, mitochondrial ridges deformed, ruptured or disappeared and mitochondria swelled; both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.01, P＜0.05) in groups B, C and D of rats compared with group A. Swimming exhaustion time lengthened significantly (P＜0.01), hepatic mitochondrial structure improved significantly and both Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities increased significantly (P＜0.01, P＜0.05) in group C compared with group B. Rat mean swimming exhaustion time shortened (P＜0.05), hepatic rough endoplasmic reticula degranulated and hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities decreased (P＜0.05) in group D compared with group B. Conclusion “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture can improve anti-fatigue ability, ameliorate hepatic mitochondrial ultrastructure, increase hepatic Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activities and promote hepatic energy metabolism in a rat model of senile yang deficiency.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Yang deficiency syndrome; Hepatic mitochondria; ATPase; “Double reinforcing and one unblocking” electroacupuncture; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.01.0063

2014-09-01

1005-0957(2015)01-0063-04

湖北省自然科学基金重点项目(2008CDA051)

刘建民(1976 - ),男,副教授

王华(1955 - ),男,教授,博士生导师,E-mail:Hwang.TCM@china.com