外周T细胞淋巴瘤患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达及临床意义

卜庆李艳丽李杨刘秀丽林静石援援康马飞付巍

作者单位：541004 桂林1桂林医学院附属医院肿瘤内科；2桂林医学院附属医院核医学科

临床研究

外周T细胞淋巴瘤患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达及临床意义

卜庆1李艳丽1李杨1刘秀丽1林静1石援援1康马飞1付巍2

作者单位：541004 桂林1桂林医学院附属医院肿瘤内科；2桂林医学院附属医院核医学科

目的 检测外周T细胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）患者外周血液精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、诱生型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）的表达，并分析其临床意义。方法 应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测25例PTCL患者化疗前、化疗后外周血液Arg-1、iNOS、VEGF的表达，分析其与临床病理特征的关系。以同期15名健康体检者作对照。结果 PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平均明显高于健康对照者（P均＜0.05），且化疗前高于化疗后（P均＜0.05）。结外侵犯部位≥2个者、有骨髓侵犯者、巨大包块直径＞10 cm者、Ann-Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期者、IPI评分为3～5分者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平分别与结外侵犯部位为0～1个者、无骨髓侵犯者、巨大包块直径≤10 cm者、Ann-Arbor临床分期为Ⅰ～Ⅱ期者、IPI评分为0～2分者比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。但不同年龄及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平的PTCL患者血清中3个因子的表达水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结论PTCL患者尤其具有高危复发特征的患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF含量显著升高，且化疗前高于化疗后，这些因子可能与PTCL发生、发展密切相关。

淋巴瘤；外周T细胞淋巴瘤；精氨酸酶1；诱生型一氧化氮合成酶；血管内皮生长因子

外周T细胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）是一种异质性较大的恶性肿瘤，表现为侵袭性强、预后差等特点。目前尚没有针对PTCL的标准治疗方案，临床试验仍然是首选的策略之一［1，2］。近期研究发现精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）可以分解环境中存在的T细胞活化所必需的氨基酸——精氨酸，进而导致CIM+和CD8+T细胞活化受阻；此外，其代谢精氨酸产物亦对T细胞增殖和功能具有抑制作用。诱生型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促进肿瘤内微血管生成，为肿瘤生长提供营养支持。基于Arg-1、iNOS、VEGF的作用机制均有利于肿瘤生长，由此推测Arg-1、iNOS、VEGF可能在肿瘤发生、发展或转移过程中扮演重要角色。为此，本研究通过检测PTCL患者及其化疗前、化疗后血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量，并探讨其临床意义，以期为PTCL治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2013年10月至2014年7月于桂林医学院附属医院、桂林市人民医院、广西壮族自治区南溪山医院接受治疗的PTCL患者25例，其中男14例，女11例，年龄11～75岁，平均（43.5±17.2）岁。所有患者均符合以下条件：⑴经病理检查证实为初治或复治的PTCL患者；⑵ECOG评分为0～3分；⑶心、肺、肝、肾等主要器官功能正常；⑷骨髓功能正常：WBC＞3.0×109/L，PTL＞80×109/L，Hb＞100 g/L；⑸无活动性高血压病和糖尿病，无精神和心理障碍。选取同期15名健康人群作对照，其中男10例，女5例，年龄23～70岁，平均年龄（45.8±14.3）岁。两组性别、年龄等一般临床资料差异无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。所有入组人员均签署知情同意书，并获本单位医学伦理委员会批准。

1.2 标本采集

采集清晨空腹外周静脉血液5 ml，放入真空无抗凝采血管中，室温存放4 h，3 300 r/min离心10min，分离上层血清至1.5ml离心管中，置于-80℃冰箱中保存、待测。化疗前及化疗4个疗程后复查时各采血1次。

1.3 化疗方案

25例PTCL患者中7例采用CHOP方案化疗，环磷酰胺750 mg/m2，静脉滴注，d1；阿霉素50 mg/m2，静脉滴注，d1；长春新碱1.4 mg/m2，静脉滴注，d1；强的松60 mg/m2，口服，d1～d5。18例采用CHOPE方案化疗，环磷酰胺750mg/m2，静脉滴注，d1；阿霉素50mg/m2，静脉滴注，d1；长春新碱1.4 mg/m2，静脉滴注，d1；强的松60 mg/m2，口服，d1～d5；依托泊苷100 mg/m2，静脉滴注，d1～d3。每3周为一个周期，所有患者均接受4个周期化疗。

1.4 主要试剂、仪器及检测方法

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测目标血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达，最低检测浓度分别为1.56 ng/ml、0.9 IU/m l、15.6 pg/ml。抗人Arg-1抗体、抗人iNOS抗体、抗人VEGF抗体均购自深圳欣博胜生物科技有限公司。三者均被包被于酶标板上，加入生物素化的抗人Arg-1单抗、抗人iNOS抗体、抗人VEGF抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合；抗人Arg-1抗体、抗人iNOS抗体、抗人VEGF抗体与结合在单抗上的人血清Arg-1、iNOS、VEGF结合形成免疫复合物，洗去游离成分。加入显色底物，若反应孔中有血清Arg-1、iNOS、VEGF辣根过氧化物酶会使无色的显色剂显蓝色，加终止液使其变黄，用酶标仪（购自帝肯贸易有限公司）在450 nm波长处测其OD值。人Arg-1、iNOS、VEGF浓度与OD450值成正比，通过绘制标准曲线计算标本血清中Arg-1、iNOS、VEGF的浓度。

1.5 疗效评价

患者接受4个周期的CHOP或CHOPE方案化疗后予CT复查，按照NHL国际疗效判断标准评价近期疗效，分为完全缓解（CR），部分缓解（PR），疾病稳定（SD）和疾病进展（PD），以CR+PR计算总有效率（RR）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理。两组计量资料的比较若符合正态分布，采用独立样本t检验或配对样本t检验；若不符合正态分布，采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Pearson法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTCL患者及健康对照人群血清中Arg-1、iNOS、VEGF表达水平的比较

PTCL患者和健康对照人群血清中均能检测到Arg-1、iNOS、VEGF的表达，但3个因子在PTCL患者血清中的表达水平均显著高于健康对照人群［（17.09±2.56）ng/ml vs（10.93±1.08）ng/ml，P＜0.001；（21.90±3.65）IU/ml vs（16.39±6.08）IU/ml，P=0.01；（37.46±38.73）pg/ml vs（15.82±8.37）pg/ml，P=0.012）］。

2.2 PTCL患者化疗前与化疗后血清中Arg-1、iNOS、VEGF表达水平的比较

PTCL患者化疗前血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平分别为（15.88±2.71）ng/ml、（18.15±4.61）IU/ml和（37.46±38.73）pg/ml，化疗后3个因子的表达水平分别为（13.99±2.92）ng/ml、（15.02±4.03）IU/ml和（15.47±19.15）pg/ml，与化疗前比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

2.3 PTCL患者化疗疗效与其血清中Arg-1、iNOS、VEGF表达水平的比较

25例PTCL患者接受4个周期CHOP或CHOPE方案化疗后，获CR 5例，PR 7例，SD 3例，PD 10例，RR为48%（12/25）。化疗后疗效评价为CR和PR的12例患者血清中Arg-1表达水平为（15.19±3.03）ng/ml、iNOS为（16.61±6.27）IU/ml、VEGF为（31.63±38.54）pg/ml，分别与获得PD的10例患者血清中Arg-1的表达水平（16.53±2.31）ng/m l、iNOS表达水平（19.54±1.40）IU/ml、VEGF表达水平（42.85±39.67）pg/ml进行比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.4 PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平与患者临床病理特征的关系

PTCL患者中，结外侵犯部位≥2个者、有骨髓侵犯者、巨大包块直径＞10 cm者、Ann-Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期者、IPI评分为3～5分者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平分别与结外侵犯部位为0～1个者、无骨髓侵犯者、巨大包块直径≤10 cm者、Ann-Arbor临床分期为Ⅰ～Ⅱ期者、IPI评分为0～2分者的表达水平比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。但不同年龄及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平的PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平与其临床病理特征的关系（±s）

表1 PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达水平与其临床病理特征的关系（±s）

临床病理特征 n Arg-1（ng/ml） P iNOS（IU/ml） P VEGF（pg/ml） P总例数 25年龄（岁）0.155 0.202 0.290 <45 10 14.93±2.74 16.68±5.93 27.22±31.29≥45 15 16.52±2.58 19.12±3.36 44.28±42.63 LDH水平 0.382 0.119 0.188正常 8 15.29±2.80 16.37±6.07 24.80±28.89升高 17 16.29±2.67 19.32±3.01 45.90±42.95结外侵犯部位（个） 0.006 0.014 0.018 0～1 15 14.16±2.50 15.45±6.30 15.64±20.20≥2 10 17.04±2.24 19.94±1.52 52.01±41.74

（续表）

2.5 PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的表达的相关性分析

采用Pearson相关性分析，结果显示PTCL患者血清中iNOS与VEGF表达呈正相关（r=0.572，P＜0.005），Arg-1与VEGF表达亦呈正相关（r=0.417，P=0.038），而Arg-1与iNOS的表达无相关性（r=0.342，P=0.483）。

3 讨论

PTCL的发生率相对较低，但容易对化疗药物耐药［2］，异质性较强，目前尚缺乏有效的单克隆抗体治疗，大剂量化疗联合自体干细胞移植的治疗效果亦尚存争议［3］，目前对PTCL的治疗尚缺乏大规模临床随机对照试验结果做指导，对其治疗面临巨大挑战。本研究基于Arg-1、iNOS、VEGF的作用机制均有利于肿瘤的生长，国内外多项研究虽报道了Arg-1、iNOS、VEGF在多种实体瘤中均呈高表达［4～6］，且与疗效和预后密切相关［7～10］，但目前尚未见PTCL与Arg-1和iNOS的相关报道。因此尝试通过检测PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量，并分析其临床意义，旨在寻找在PTCL发生、发展中起重要作用的相关因子，并为针对这些因子探索新的治疗干预途径提供新的思路。

本课题组前期实验研究发现PTCL患者外周血中存在髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells，MDSC），且在癌细胞中发挥重要作用［11］。MDSC可以表达高水平的Arg-1和iNOS，诱导T细胞阻滞在G0/G1期［12］，抑制T细胞活化，使肿瘤细胞逃避免疫系统的监视，从而促进肿瘤生成和复发。Christiansson等［13］报道在慢性粒细胞白血病患者外周血中发现与MDSCs相关的Arg-1表达升高，且与免疫抑制相关。iNOS可催化左旋精氨酸形成一氧化氮，不但可调节肿瘤血管形成，还可诱导VEGF促内皮细胞迁移和血管生成，其代谢产物可造成DNA损伤，促进肿瘤生成。而本研究亦显示Arg-1、iNOS与VEGF的含量呈正相关,说明这两个因子的升高可能促进了VEGF的分泌。Üsküdar等［14］发现侵袭性非霍奇金淋巴瘤诊断时，患者血清中VEGF含量高于健康人群。以上研究提示Arg-1、iNOS、VEGF在肿瘤的发生、发展过程中发挥一定作用。而本研究结果亦显示，PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量较健康对照人群显著升高，与上述研究结果基本一致。分析原因可能与PTCL造成的免疫抑制及PTCL侵袭性强，从而需要VEGF促内皮细胞迁移和血管生成而促进肿瘤浸润有关。由此推测Arg-1、iNOS、VEGF可能是PTCL发生、发展的重要相关因子。

化疗是PTCL的主要治疗方法，但目前国内外尚未见化疗前后PTCL患者血清中Arg-1、iNOS含量比较的相关报道。而有关VEGF的研究，Dincaslan等［15］报道治疗前儿童淋巴瘤患者血清中VEGF的含量高于缓解期。为研究PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF含量与化疗疗效的关系，本研究比较PTCL患者化疗前后血清中Arg-1、iNOS、VEGF表达的差异，结果发现化疗后3个因子的表达水平均明显低于化疗前，可能由于化疗后免疫细胞及肿瘤内处于增殖期的血管内皮细胞受损减少，从而导致免疫抑制因子Arg-1、iNOS及VEGF的血清含量亦减少。但进一步比较化疗疗效评价为CR和PR的患者与评价为PD的患者血清中3个因子的含量却未发现明显差异。提示PTCL患者血清中3个因子的表达可能对降低肿瘤负荷作用不大，但可能与Arg-1和iNOS诱导的免疫抑制改善有关，相关方面还需要进一步研究加以验证。

另外，本研究通过比较不同临床病理特征的PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量，结果发现具有高危复发特征的患者，如结外侵犯部位≥2个者、有骨髓侵犯者、巨大包块直径＞10 cm者、Ann-Arbor临床分期为Ⅲ～Ⅳ期者、IPI评分为3～5分者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量显著上升。分析原因可能由于这些具有高危复发特征的患者肿瘤负荷较大、侵犯范围较广且侵袭性较强，从而导致机体的免疫抑制更严重，亦需更多的VEGF以协助肿瘤细胞广泛地浸润。由此认为，联合检测PTCL患者血清中Arg-1、iNOS、VEGF的含量可能对判断肿瘤转移、复发具有重要意义，再次证实Arg-1、iNOS、VEGF可能在PTCL发生、发展过程中发挥重要作用，有关方面值得进一步深入研究加以证实。

综上所述，本研究结果显示，Arg-1、iNOS、VEGF在PTCL患者血清中的含量相对于健康人群显著升高，化疗前高于化疗后，具有高危复发特征的患者其含量亦显著升高，由此认为Arg-1、iNOS、VEGF有望作为PTCL判断不良预后的评价因子，联合检测PTCL患者血清中3个因子的含量对判断疾病进展具有一定价值。但目前有关这3个因子在PTCL中的研究较少，而本研究由于样本量、检测方法等有待进一步完善，未来需扩大样本量、完善设备后进行临床追踪研究，以进一步评估Arg-1、iNOS、VEGF在PTCL诊治中的临床价值，为制订PTCL治疗方案提供新的思路。

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［2015-05-20收稿］［2015-06-18修回］［编辑 罗惠予］

Clinical significance of elevated serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF in patients w ith peripheral T-cell lymphoma

BU Qing1，LIYanli1，LIYang1，LIU Xiuli1，LIN Jing1，SHI Yuanyuan1，KANG Mafei1，FU Wei2（1Department of Medical Oncology，Affiliated Hospital of Guilin Medical College；2Department of Nuclear Medicine，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004，P.R.China）

BUQing.E-mail：buqing1993@qq.com

Lymphoma；Peripheral T-cell lymphoma；Arginase-1；Inducible nitric oxide synthase；Vascular endothelialgrowth factor

R733.4

A

1674-5671（2015）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.05

广西自然科学基金青年基金资助项目（2011GXNSFB018092）

卜庆。E-mail：buqing1993@qq.com

【Abstract】Objective To analyze the relationship of serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF with clinical characteristics in patients with peripheral T-cell lymphoma（PTCL）.M ethods We compared ELISA-determined serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF in peripheral blood in 25 patients with PTCL before and after chemotherapy.As a control，we measured the same serum levels in 15 healthy individuals.Results PTCL patients showed significantly higher serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF than healthy controls（P＜0.05）.Serum levels in patients decreased significantly after chemotherapy（P＜0.05）.Elevated serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF correlated with extranodal involvement，bone marrow involvement，bulky disease（diameter＞10 cm），disease stagesⅢ-Ⅳ and 3 to 5 IPI score（P＜0.05）.However，elevated serum levels of the three factors did not correlate with age or LDH level（P＞0.05）.Conclusion In PTCL，elevated serum levels of Arg-1，iNOS，and VEGF may correlate with worse clinical characteristics，and chemotherapy can significantly reduce the levels.This three factors may closely correlated with the occurrence and progression of PTCL.