Nav1.6在口腔颌面部鳞状细胞癌组织中的表达

向 娟，蔡伯慧，王 润，蒋勇

Nav1.6在口腔颌面部鳞状细胞癌组织中的表达

向 娟，蔡伯慧，王 润，蒋勇

目的探讨Nav1.6在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，以及Nav1.6在口腔鳞状细胞癌发生中的相关性。方法采用免疫组化SP法、荧光定量PCR法，对50例口腔鳞癌组织及16例非癌症组织中Nav1.6表达进行检测，利用仪器对结果进行分析。结果口腔鳞癌组织中Nav1.6的表达量高于非癌症组织。随着分化程度的增高，Nav1.6的表达量逐渐减少。其表达量与患者年龄、性别、肿瘤部位、有无淋巴结转移无关。结论Nav1.6的上调可能与口腔鳞癌的生物学行为有关，其作用机制有待进一步研究。

口腔鳞状细胞癌；电压门控型钠离子通道；Nav1.6

口腔颌面部的恶性肿瘤中绝大多数为鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），占80%以上［1］。OSCC发病率正逐年上升，对患者生命构成了严重威胁［2］，其晚期转移和复发是口腔颌面外科临床医师不得不面对的一个棘手问题。多年来研究人员一直对OSCC的转移机制进行探讨，但至今尚无一种特异并敏感的肿瘤标志物能准确诊断早期肿瘤并确定其恶性程度。电压门控型钠离子通道（voltage-gated sodium channel，VGSC）为多亚基的跨膜糖蛋白，由一个α亚单位和β亚单位组成。α亚单位是钠通道的功能性亚单位［3］，由Nav1.1-Nav1.9共9个亚型组成，分布于不同的组织、细胞［4］。VGSC在“非兴奋”细胞（内皮细胞、骨细胞等）和一些癌症细胞（乳腺癌、卵巢癌等）中表达，涉及癌症细胞的迁移和侵袭［5］。VGSC中Nav1.6亚型与其他钠离子通道亚型相比，其表达的癌症种类最多，而且在每种癌症中其表达量也最高。这已经在人类宫颈癌、前列腺癌［6－10］等癌症中得到证实，并且Nav1.6通道的表达或点活动可显著影响肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本收集和处理 于安徽医科大学第一附属医院口腔颌面外科病房收集50例OSCC患者术中切除的癌症组织，被收集的病例要求仅患有口腔颌面部鳞状细胞癌，未曾患有其他癌症或疾病等。收集的所有标本术后病理诊断为鳞状细胞癌。患者年龄40～70（60.21±5.11）岁，男30例，女20例。高分化15例，中分化19例，低分化16例。舌癌21例，颊黏膜癌18例、牙龈癌等11例。另收集非癌症组织16例，如来自拔牙患者术中切除的牙龈组织、唾液腺囊肿等术中切除的非癌症组织。以上组织收集后均立即冻存于－80℃冰箱。

1.1.2 主要试剂与仪器 兔抗人SCN8A（Nav1.6）多克隆抗体（北京博奥森生物有限公司）；SP试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物科技公司）；DL 2 000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批号：B7301A）；TRIzol（美国Invitrogen公司，批号：14105）。CH20BIMF 200显微镜（日本OLYMPUS公司）；K960型PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；LX300型低速迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；PIKOREAL 96荧光定量PCR仪（芬兰Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR法检测Nav1.6的表达 将收集好的组织取一部分用作荧光定量PCR。根据Nav1.6的基因序列设计并合成引物，上游引物：5′-CTTGGTCATATTGTGGGTTCTTTC-3′，下游引物：5′-TGTGCCTCTTCCTGTTGCTTCTTA-3′，引物长度165 bp。β-actin上游引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，引物长度185 bp。利用TRIzol分别提取非癌症组织和OSCC组织的RNA。分别取3 μg总RNA做逆转录反应。逆转录后再分别取1μl反应液做为荧光定量的模板。反应条件为：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、30 s，40个循环。反应结束由系统自动计算定量结果。

1.2.2 免疫组化法检测Nav1.6的表达 将收集好的组织取另一部分用做免疫组化。用4%甲醛溶液固定组织，石蜡包埋组织，制成蜡块，做4μm厚连续切片，甲醛溶液浸泡切片溶解石蜡，放入50℃电热干燥20min，放入梯度酒精中脱水，清水冲洗。再将切片放入柠檬酸钠溶液中，高温加热10min，冷却10min，再高温5min，冷却至室温。将每张切片拭干多余水分，滴加H2O2，37℃恒温箱孵育30min；PBS溶液冲洗3遍，滴加一抗，4℃冰箱放置过夜，PBS冲洗后，滴加二抗；PBS冲洗，滴加DAB显示剂，显微镜下观察，冲洗干净切片。苏木精行细胞核染色，冲洗干净后放入干燥箱干燥。封片后显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 免疫组化结果判定 在光镜下观察，凡是细胞膜和细胞质出现黄色至棕黄色颗粒为阳性。在200倍视野下，每例切片随机选取5个不重复、不重叠的视野，采用双评分定量积分法［11］对非癌症组织和OSCC组织中阳性细胞百分数和着色强度进行分析。即根据阳性细胞百分数评分：＜5%（0分）；6%～25%（1分）；26%～49%（2分）；50%～74%（3分）；≥74%（4分）。再根据阳性细胞着色强度评分：细胞无染色（0分）；弱染色（1分）；染色清楚（2分）；强染色（3分）。最后，以两者得分相乘判断免疫组化的结果，可以分为：阴性（－）：0分；弱阳性（＋）：1～4分；中度阳性（＋＋）：5～8分；强阳性（＋＋＋）：9～12分。为了使统计方便，将弱阳性、中度阳性、强阳性统称为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行分析，数据以±s表示，分别进行χ2检验。

2 结果

2.1 荧光定量PCR法检测Nav1.6的表达经过熔解曲线（图1）测定，得到了特异性的单峰扩增产物，并且解链温度在80℃左右，产物单一，引物特异性较好，无非特异性扩增产物。各个样本的扩增曲线平行性好，扩增效率基本一致（图1）。本次实验使用relativequantificationstudy的方法分析，采用的指标为2－ΔΔCt。非癌症组织、高分化鳞癌组、中分化鳞癌组、低分化鳞癌组中Nav1.6mRNA平均相对表达量比较差异有统计学意义（P＜0.05）。方差分析后，非癌症组与高、中、低分化鳞癌组方差分析F值分别为：3.80、3.97、4.89，高分化组与中、低分化组方差分析F值分别为3.50、4.07，中分化组与低分化组F值为3.558。荧光定量PCR结果显示，非癌症组织和OSCC组织中Nav1.6的表达量有明显差异，在OSCC组织中Nav1.6的表达量随着肿瘤的分化程度增加而降低，见表1。

2.2 免疫组化检测Nav1.6的表达免疫组化结果显示，Nav1.6在非癌症组织和OSCC组织中均有阳性表达，主要位于细胞膜和细胞质，阳性表达为黄色至棕黄色颗粒。对16例非癌症组织观察发现，有2例偶有少量Nav1.6表达，呈淡黄色染色，见表2，绝大多数非癌症组织呈阴性表达，见图2A。50例OSCC组织中，较强的染色多分布在癌巢、角化珠中。在癌症大部分间质中呈阴性表达，间质中浸润的炎性细胞也有少量染色。在这些癌症组织中，利用上述双评分定量积分法得出：高分化鳞癌中阳性8例（弱阳性3例、中度阳性5例）。中分化鳞癌中阳性15例（弱阳性4例、中度阳性3例、强阳性8例）。低分化鳞癌中阳性16例（弱阳性5例、中度阳性5例、强阳性6例）。总计得出，在OSCC中，阴性11例，阳性39例。Nav1.6在不同性别（P＝0.443）、不同部位（P＝0.843）的表达情况差异均无统计学意义，淋巴结转移组和无淋巴结转移组之间差异也无统计学意义（P＝0.571），不同分化程度各组之间比较，差异有统计学意义（P＝0.012）。可见Nav1.6在OSCC中的表达与患者的性别、肿瘤部位、有无淋巴结转移无相关性，与肿瘤的分化程度相关。见表3、图2。

表1 非癌症组织和OSCC组织中Nav1.6的表达

表1 非癌症组织和OSCC组织中Nav1.6的表达

与非癌症组比较：*P＜0.05；与高分化组比较：＃P＜0.05；与中分化组比较：△P＜0.05

组别n Nav1.6平均相对表达量非癌症16 1.00±0.14 OSCC高分化15 2.31±0.52*中分化19 4.46±0.58*＃低分化16 8.86±1.63*△

表2 Nav1.6在非癌症组织和OSCC中的表达

表3 Nav1.6在OSCC中的表达与临床病例参数之间的关系

3 讨论

Nav1.6做为一种细胞形成动作电位过程中重要的组成构件，与多种疾病相关。目前研究［12］证实Nav1.6在各类癌症中，尤其是宫颈鳞状细胞癌中的高表达被认为是新型的肿瘤标志物。利用荧光定量PCR法以及免疫组化法等证实了在OSCC中也存在Nav1.6的表达，而且OSCC组织中的表达明显高于口腔非癌症组织，提示Nav1.6可能参与了OSCC的发病。Nav1.6由Schaller et al［13］在大鼠的中枢及周边神经系统中发现，是由SCN8A基因编码的，编码1 976个氨基酸。在人类中，基因的染色体定位为12q。Nav1.6在中枢神经系统中广泛而均匀地表达，仅少数表达于周围神经系统。研究［6－10］显示Nav1.6在肿瘤细胞中也有明显的表达，这些已经在人类宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤和恶性胸膜间皮瘤中得到证实。但是目前对于VGSC促使癌症细胞侵袭、转移的机制仍然不完全清楚。有些学者认为，钠离子通道影响细胞的增殖途径可能与通过影响K＋或Ca2＋的通透性或电活动以及作用于细胞生长有关的信号转导通路有关［14］。

通过荧光定量PCR，可以观察到在非癌症组织和OSCC组织中均有Nav1.6的表达。但OSCC组织中的平均相对表达量明显大于非癌症组的平均相对表达量，这一结果与Hemandez-Plata et al［15］在宫颈癌中的研究结果一致。提示Nav1.6可能与OSCC的发病有关，并且与OSCC的分化程度呈负相关性。

免疫组化结果进一步显示，Nav1.6在OSCC组织中阳性表达率明显高于非癌症组织。Nav1.6的表达量与OSCC组织分化程度相关。在高分化、中分化、低分化组织中其阳性表达率不同，表达量与分化程度呈负相关性。研究还显示Nav1.6的表达与患者的性别、肿瘤生长的部位、有无淋巴结转移等因素无关。这与收集组织标本中患者的个体差异、实验样本量较小，以及其他多种相关因素有关。需要扩大样本量继续验证，也需要对患者进行长期跟踪随访，以进一步观察Nav1.6与OSCC之间的关系。

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Expression of voltage-gated sodium channel Nav1.6 in oral squamous cell carcinom a

Xiang Juan，Cai Bohui，Wang Run，et al
（Dept of Preventive Dentistry，Stomatologic Hospital and College，AnhuiMedical University＆Key Laboratory of Oral DiseasesResearch of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression of Nav1.6 in oral squamous cell carcinoma and the relationship between Nav1.6 and the developmentof oral squamous cell carcinoma.MethodsImmunohistochemistry，real-time quantitative PCR were used to detect the expression of Nav1.6 in carcinoma and normal human oral tissue.The the results were analyzed by using instruments.ResultsThe results revealed that the expression of Nav1.6 in oral squamous cell carcinoma increased significantly in comparison with the normal oral tissue.The higher the degree of tumor differentiation，the less the expression of Nav1.6.And the expression of Nav1.6 had nothing to do with age，sex，the site of tumor and themetastasis of lymph nodes.ConclusionThe up-regulated levelof Nav1.6mRNA in oral squamous cell carcinoma tissue is significantly associated with the pathogenesis of OSCC.

oral squamous cell carcinoma；voltage-gated sodium channel；Nav1.6

R 780.2

A

1000－1492（2015）08－1157－04

2015－04－22接收

安徽省科技厅年度计划（编号：12070403062）

安徽医科大学口腔医学院口腔预防医学教研室，合肥

230032

向 娟，女，硕士研究生；

蒋 勇，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：j6263＠163.com