芸香苷通过PI3K／AKT信号通路抑制H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡

郭 彬，周艳峰

芸香苷通过PI3K／AKT信号通路抑制H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡

郭 彬，周艳峰

目的探讨PI3K／AKT信号通路是否参与芸香苷对过氧化氢（H2O2）诱导人晶状体上皮细胞（HLEC）凋亡的抑制作用。方法将培养的HLEC分为4组：空白对照组、H2O2组、芸香苷组、LY294002组；采用MTT法测细胞存活率，Western blot法检测p-AKT及AKT的表达，Annexin VFITC／PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果H2O2可诱导HLEC发生凋亡，与H2O2组相比，芸香苷组不仅使AKT的磷酸化水平显著升高，还降低了细胞凋亡率（P＜0.01）；在LY294002干预组，PI3K／AKT信号通路的特异性阻断剂LY294002明显抑制了芸香苷组中各项指标的变化，差异有统计学意义（P＜0.01），但与H2O2组比较，差异无统计学意义。结论芸香苷抑制H2O2诱导的HLEC凋亡可能与PI3K／AKT信号通路有关。

芸香苷；人晶状体上皮细胞；PI3K／AKT信号通路；H2 O2

白内障是当今世界范围致盲率最高的眼病。一般认为，自由基引起的晶状体上皮细胞氧化损伤及凋亡是白内障发生的主要因素［1］。在大量关于抑制H2O2诱导细胞凋亡的文献中，无论使用白藜芦醇、黄芪苷还是芸香苷干预，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信号通路都参与其抗凋亡机制［2－3］。但PI3K／AKT信号通路是否参与芸香苷对HLEC的抗凋亡作用，其作用机制尚未见相关报道。芸香苷又被称为维生素P，是天然黄酮类化合物。目前研究［4－6］表明，芸香苷拥有抗病毒、抗炎、抗高血压、抗氧化等功能。早在1994年，Grinberg et al［7］报道芸香苷可保护血红蛋白免受百草枯（paraquat，PQ）诱导的氧化作用。该研究初步探讨芸香苷对晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LEC）的保护作用与PI3K／AKT信号通路的关系，为芸香苷在白内障早期防治中提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells，HLEC）（上海复蒙基因生物科技有限公司）；30%H2O2（上海中试化工总公司）；Rutin（纯度＞98%，南京泽郎医药科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶、LY294004、RIPA裂解液、PMSF、ECL显色液（海门市碧云天生物技术研究所）；DMEM培养液、胎牛血清（美国GIBCO BRL公司）；β-actin、p-AKT、AKT抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根酶标记山羊抗小鼠／兔（北京中山金桥生物技术有限公司）；Annexin V-FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物有限公司）

1.2 细胞的复苏与培养将冻存的HLEC立即放入37℃水中快速摇晃，直至冻存液完全融化，接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5% CO2培养箱内培养，隔日观察换液；待贴壁细胞长至融合时，用胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 实验分组实验分为4组，对照组：HLEC＋DMEM培养液；H2O2组：正常组＋H2O2（终浓度200 μmol／L）；芸香苷组：H2O2组＋芸香苷（终浓度100 μmol／L）；LY294002组：LY294002（终浓度14μmol／L）＋芸香苷（100μmol／L）＋H2O2（200μmol／L）。芸香苷、H2O2的浓度是从前期研究结果中筛选出来的最佳浓度。

1.4 MTT测细胞生存率取2块96孔板，接种以5×103细胞／孔的对数生长期细胞，每孔加100μl的培养基，在37℃、5%CO2条件下培养24 h后，其中1块96孔板加入200μmol／LH2O2后放入细胞培养箱中分别培养12、24、48 h（设计的空白对照组除外）；另1块板除空白组外，加入100μmol／L芸香苷后分别培养30 min、1、2、4 h后，加入200μmol／L H2O2再培养24 h。将加完药的两板取出，每孔分别加入5 g／LMTT 20μl继续孵育，4 h后取出弃上清液，每孔加入150μl的DMSO，常温震荡10 min后，用酶标仪测定490 nm波长下的吸光度（absorbance，A）值。每板实验重复2次。

1.5 AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率H2O2组为用200μmol／L H2O2处理细胞24 h；芸香苷组为用100μmol／L芸香苷预处理细胞1 h后加入200μmol／L H2O2处理24 h；LY294002组为14μmol／L LY294002预处理细胞30 min后，加入100μmol／L芸香苷处理1 h，最后加入200μmol／L H2O2孵育24 h。细胞接种于6孔板，按要求给予不同的因素处理后，弃去培养液，每孔加入0.25%胰酶（不含EDTA）500μl，37℃消化3 min后吹打成单细胞悬液并收集，4 000 r／min离心3 min，弃上清液。冷PBS洗涤细胞后离心弃上清液，加入500μl IX AnnexinV结合液吹打结合悬浮细胞后，分别加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI染色，轻轻摇匀后放置4℃避光保存15 min.每个样本计数不低于10 000个细胞，采用荧光强度值并以Multicycle软件处理结果，计算凋亡率。

1.6 Westernblot法检测p-AKT的表达各组细胞经实验处理后，使用冰冷的PBS洗涤细胞2次，每孔按1∶100的比例加入RIPA裂解液与PMSF的混合液，4℃裂解15 min，细胞裂解物12 000 r／min离心10min，取上清液，调整样品的蛋白量按照1∶5的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，水浴煮沸5 min。将样品电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上（130 mA恒定电流转移3 h），室温下用还有5%脱脂奶粉（PBS溶解）封闭PVDF膜1 h。随后加入一抗（1∶300）4℃孵育过夜。PBS洗脱3次，加入相应的二抗（1∶10 000），孵育2 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂染1 min，暗室中曝光到X线片上。Image J软件进行灰度分析。

1.7 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 结果

2.1 H2O2处理时间的选择根据前期实验结果，此次选择200μmol／L为H2O2的实验浓度，分别处理HLEC 12、24、48、72 h后，MTT测其对细胞生存率的影响。细胞生存率随着时间的增加呈下降趋势，与正常组相比，差异有统计意义（P＜0.01）。而24 h值最接近细胞生存半数抑制率（50%inhibition rate，IC50）。因此在实验中，选择24 h为H2O2处理细胞的时间。

2.2 芸香苷预处理时间选择根据前期实验结果，此次选择100μmol／L为芸香苷的实验浓度，分别预处理细胞30 min、1 h、2 h、4 h。MTT测其对细胞生存率的影响。各组细胞生存率较空白对照组相比，有所下降（P＜0.01），但各组之间的细胞生存率差异无统计学意义，且在1 h时为最高（78.73± 8.74）%，随后，细胞生存率逐渐降低。因此选择1 h为芸香苷预处理的最佳时间，见图2。

2.3 流式细胞仪测各组细胞凋亡率H2O2组的细胞凋亡率最高。加入芸香苷预处理后，细胞凋亡率较H2O2组明显降低（P＜0.01），与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；LY294002抑制芸香苷的保护作用，使细胞凋亡率再次升高（P＜0.01），与H2O2组相比，差异无统计学意义，见图3。

2.4 Westernblot测各组p-AKT的表达与对照组相比，H2O2组及LY294002组的p-AKT相对表达量下降（P＜0.01），芸香苷组p-AKT的相对表达量升高（P＜0.01）；与芸香苷组相比，加入抑制剂LY294002后p-AKT的灰度值由（39.77±5.85）%降到（17.64±4.55）%，差异有统计学意义（P＜0.01），而与H2O2组比较差异无统计学意义；总的AKT相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

3 讨论

LEC是存在于前囊下、赤道弓部及赤道部的单层立方上皮细胞，具有分化、增殖功能，在维持晶状体透明性及稳定性中起重要作用。一旦LEC受到辐射、药物、外伤等慢性损伤时，可产生大量的活性氧，后者通过损害线粒体及能量代谢，使抗凋亡基因表达受阻，最终导致细胞凋亡。活性氧破坏正常的LEC功能，引起晶状体浑浊，导致白内障的发生［1］。

H2O2属于活性氧一员，是最常见的氧化剂。相关文献［8］报道，老年性白内障患者房水中H2O2含量高于正常人2倍。因此本实验采用H2O2作为体外细胞氧化损伤模型。H2O2浓度已从前期实验结果中筛选出来，选取0～72 h为H2O2处理时间，MTT测其存活率。结果显示细胞生存率随着时间的增加而下降，在24 h时，其生存率50.95%最接近细胞IC50，最终选择24 h为本实验H2O2处理时间。

芸香苷可从荞麦花、红茶、苹果、芸香叶等植物中提取出来，清除氧自由基、减少脂质过氧化物的生成，发挥抗氧化作用［9－10］。前期实验［11］已证实芸香苷对H2O2诱导的HLEC凋亡有保护作用，且其浓度也从前期实验结果中筛选出来。笔者选取30 min～4 h为其预处理时间，MTT测其存活率。结果显示，芸香苷在预处理1 h时，细胞存活率最高，随后细胞生存率与时间呈负相关，因此最终选择1 h为本实验芸香苷预处理时间。

PI3K是参与细胞内信号转导的重要信号分子之一。AKT（又名蛋白激酶B，PKB）是原癌基因CAKT的表达产物。PI3K可调控AKT的激活，磷酸化的AKT进一步激活或者抑制下游靶蛋白，参于细胞增殖、迁移、存活及新陈代谢等多种生理活动［12］。因其具有抗凋亡作用，在临床疾病机制中越来越备受关注。Wang et al［13］研究表明，PI3K／AKT信号通路与肿瘤细胞的增殖有关；研究［14］表明PI3K／AKT信号通路参与LEC的增殖、迁移，与后发障的形成有关。而特异性抑制剂LY294002可阻断PI3K／AKT途径活化，抑制其抗凋亡作用。

本实验首次在体外H2O2诱导HLEC凋亡模型中加入抗氧化剂芸香苷，试图探讨PI3K／AKT信号通路在芸香苷抑制H2O2诱导的HLEC凋亡中的作用。流式细胞术及Western blot结果显示，与对照组相比，H2O2能引起细胞凋亡，降低p-AKT的相对表达量；芸香苷能逆转H2O2引起的氧化损伤，同时p-AKT高表达，但在芸香苷处理细胞之前加入PI3K／AKT信号通路阻断剂LY294002后，AKT磷酸化被抑制，细胞凋亡率再次升高，且与H2O2组无明显差异。

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Rutin inhibits hydrogen peroxide-induced apoptosis through PI3K／AKT signaling pathway in human lens epithelial cells

Guo Bin，Zhou Yanfeng
（Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore whether PI3K／AKT signaling pathway participates in the inhibiting effectof Rutin on H2O2-induced apoptosis in human lens epithelial cells（HLEC）.MethodsHLEC were divided into four groups：control group，H2O2group，rutin group，LY294002 group.Cell survival rateswere determined by a 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）assay；cell apoptosis rates weremonitored by flow cytometry with Annexin V-FITC and propidiun iodide（PI）staining.Western blot was used tomeasure the expression levels of AKT and p-AKT.ResultsH2O2induced HLEC apoptosis.Compared with H2O2group，rutin group not only increased the expression lever of p-AKT，but also reduced cell apoptosis rate（P＜0.01）.In LY294002 group，LY294002，an inhibitor of PI3K／AKT signaling pathway，could significantly block the change of these indexes produced by rutin group（P＜0.01），butno significant change compared with H2O2group.ConclusionRutin inhibits H2O2-induced cell apoptosis and may be associated with PI3K／AKT signaling pathway.

rutin；human lens epithelial cells；PI3K／AKT signaling pathway；hydrogen peroxide；cell apoptosis

R 776.1

A

1000－1492（2015）08－1107－04

2015－03－13接收

安徽省卫生厅中医药科研计划课题（编号：2012zy50）作者单位：安徽医科大学第一附属医院眼科，合肥 230022

郭 彬，女，硕士研究生；

周艳峰，女，副主任医师，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：Lizzhou＠163.com