代谢组学的中医证候研究进展

刘晏 汪悦

【摘 要】 整理近5年的代谢组学文献，从实验研究和临床研究2个方面，对代谢组学在中医证候本质研究领域的应用进展进行综述。

【关键词】 代谢组学；中医证候；综述

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.11.017

辨证论治是中医药理论体系的核心，是中医认识疾病和治疗疾病的原则。中医证候本质的现代研究始终是中医药现代研究的重点与热点。当前，证候的研究方法主要是文献梳理、临床流行病学调查与证候实质几个方面[1]。这些研究方法多少存在片面性或是带有主观性，不能体现出中医证候的整体性、动态性。代谢组学是对代谢网络的最终代谢产物进行多元化的终端分析，其研究方法与中医证候整体性、动态性思想不谋而合，故能以代谢组学作为出发点和切入点来研究证型，使中医证型的研究走在科学发展的前沿。

1 代谢组学概况

代谢组学是生物学体系的重要组成部分之一，它是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后发展起来的一门新的学科，是当某一生物或细胞在受疾病或外源性物质干扰的状态下，对所有的内源性低分子量，如氨基酸、脂肪酸、糖类、维生素和脂肪等，特别是分子量 < 1000的内源性代谢产物，进行定性以及定量分析。

目前，根据代谢组学研究对象及目的，对其涵盖了4个层次的研究，即代谢物靶标分析、代谢谱分析、代谢组分析和代谢指纹分析[2]。代谢组学是一项动态的、多参数应答的新型研究技术及方法，通过对生物体系进行刺激或扰动，或随着时间的发展，根据生物体内代谢产物的变化，研究生物体系的代谢路径[3]。代谢组学研究步骤包括样品采集、预处理、数据采集、分析及解释4个部分，要求生物样品稳定性好，血清、血浆、尿液、唾液，甚至关节液等均可作为研究样品[4]。预处理、数据采集主要运用分析化学技术手段，预处理分离技术主要为气相色谱、液相色谱、毛细管电泳，使样品可通过合适的方式进行测定[5]。数据采集分析技术目前较为常用的为磁共振及质谱，两者各有优缺点：磁共振成本低，检验快速，但灵敏度较低；质谱则常与色谱技术联用，及液质联用法，其灵敏度高，既可定性又可定量[6]。

代谢组学虽然是近十几年的新兴学科，但是在中医药研究方面得到广泛的应用，且有一定的突破。证候和方剂作为直接关系到疾病诊断与疗效的两大因素，一直是代谢组学在中医药方面研究的热点，证候的模糊性和方剂的复杂性一直是研究的难点。代谢组学将复杂方剂作为一个整体，对“君臣佐使”配伍后的方剂进行药效、毒理及物质鉴定研究，同时更将证候与方剂作为整体，进一步探讨方剂与机体作用后的效应及证候的实质内涵。由此，代谢组学为中医药研究带来新的思路及方法。

2 代谢组学应用于中医证候研究的基础

中医理论核心是辨证论治，是认识疾病和治疗疾病的原则。证实质的研究是研究中医的关键。中医学认为，证是对机体在疾病发展过程中的某一阶段病因、病理、病机、病位的概括，是对疾病某一阶段的特定病理生理过程的认识，受机体内因和外界环境的影响[7]。从证的本质来看，“证”准确而简练地综合了疾病形成的多方面因素；对于一个疾病来说，证不是固定的、不变的，它是发展的、变化的。因此，对证的研究应该是从整体的角度，以动态的方法，结合多种因素进行的。

无论是病理性刺激还是生理性刺激，外界环境的改变还是体内环境的波动，都可引起机体的体液、组织中内源性代谢物发生变化，代谢组学通过对内源性代谢谱的变化进行分析，从整体上体现生物在收到多种刺激后的功能状态及变化[8]。同时由于生物样本采集的微创性和便利性，代谢组学可以对生物体进行多点的观察和评估，因此代谢组学是一项动态并且整体反应机体状态的新技术、新方法。

代谢组学与中医证候的相通性体现于整体性和动态性。代谢物的生成和合成涉及人体多个系统，证候亦是多器官、多系统病理状态，受到环境、气候等影响，故二者均是对多因素整体性分析；代谢组学显示代谢物随时间变化，种类、浓度及比例也是变化的，证候亦会随时间变化而发生传变，二者均存在随时间变化而变化的特点，故二者均具有动态性。

3 代谢组学研究中医证候学的进展

3.1 代谢组学的中医证候动物模型研究进展 基于动物模型易于复制、可重复、便于观察等优点，代谢组学在中医证候动物模型的研究十分广泛、普遍。运用国際公认的造模方式复制证候模型，使用代谢组学方法对动物的尿液或血液进行分析，以寻找证候特异性代谢标志物。在实验室条件下，排除了饮食、环境、生活习惯等因素的影响，使实验数据更加集中更具有代表性。

黎莉等[9]采用激惹、噪音以及脉冲电等刺激方式对孕后大鼠进行激惹刺激，模拟了情志不遂的病理生理状态，复制了经前期综合征的肝气逆证的大鼠模型。采用代谢组学方法检测模型组和正常对照组血浆代谢成分的差异，发现四氢脱氧皮质酮、5a-四氢皮质醇、孕二醇、雌酚酮、肾上腺素、赖氨酸、5-羟基赖氨酸和乙酰半胱氨酸共同组成经前期综合征肝气逆证模型大鼠的代谢标志物群。

霍超等[10-11]分别采用慢性放血及γ射线辐射法复制血虚证模型小鼠，肌酐、胆碱、肌酸、乳酸、低密度脂蛋白等标记物在2种模型中均有出现。经过四物汤治疗后，小鼠的细胞膜及细胞内外渗透压更加稳定，糖酵解受到调节，机体的正常能量代谢、机体抗氧化能力以及免疫力得到恢复，证实了四物汤治疗血虚证可能与以上机制相关。

刘志刚等[12]运用液质联用法对肺气虚型大鼠模型进行血浆代谢组学分析。他们采用COPD肺气虚证动物模型复制法复制慢阻肺肺气虚证模型大鼠，通过检测对照组与模型组的血浆样本，发现精胺、双氢神经酰胺、十二烷二酰肉碱等10种变化显著的内源性代谢物质，考虑可能为COPD肺气虚证的疾病标志物。

Wang等[13]采用液质联用技术对心气虚证大鼠尿液进行了代谢组学研究，并运用左冠状动脉结扎法复制心气虚证大鼠模型，找到17种潜在生物标志物。给予温心方后，使其中12种标志物回调至正常水平，证明了温心方治疗心气虚的作用，并进一步证实，温心方治疗心气虚证可能与调节糖酵解、糖异生以及嘌呤代谢途径，影响饱和及不饱和脂肪酸合成相关。

Wang等[14]运用液质联用法对肾阴虚证大鼠尿液进行代谢组学研究。他们运用甲状腺素和利血平诱导复制的肾阴虚证大鼠模型，找到20个潜在生物标志物，根据MS/MS碎片离子图鉴定其为尿酸、氨基脂肪、氨基葡萄糖等。给予六味地黄丸后，发现低剂量组与空白组代谢水平最为接近，为评价中药方剂提供新方法。

潘秋等[15]运用气质联用法对糖尿病大鼠脾气亏虚、痰瘀互阻证2种证型的尿液进行代谢组学分析研究，发现在模型组尿液中L-抗坏血酸、D-葡萄糖酸、丙氨酸、十八烷酸和戊二酸含量增加，并对产生变化代谢物的组合规律及含量改变进行分析，初步展示了糖尿病大鼠中医证候的相关代谢物特征。

陈磊等[16]运用磁共振代谢组学技术研究脾虚证大鼠脾脏中代谢物的变化规律，并初步证实补中益气汤治疗脾虚证的作用机制。实验证明，经过补中益气汤治疗后，脾虚证模型大鼠脾脏组织中乳酸、牛磺酸、次黄嘌呤的含量减少，谷氨酸、鲨肌醇的含量增高，多种代谢物的含量趋向正常，表明补中益气汤治疗脾虚证的作用可能与调节能量代谢、纠正低氧状态和增加免疫力等相关。

何丽清等[17]运用磁共振氢谱检测法对大鼠肺组织及血液样本进行代谢组学分析，对所得数据进行PLS-DA分析，发现经小青龙汤治疗后的大鼠，其肺组织中缬氨酸、苏氨酸、牛磺酸等均有所回调，血液样本中肌酸、酪氨酸、牛磺酸、脯氨酸等代谢物含量发生变化，最终得出结论，小青龙汤可以通过调节免疫力、能量代谢及干扰炎症反应等途径对慢性阻塞性肺病寒饮蕴肺证起到治疗作用。

杨宇峰等[18]运用液质联用法观察监测血浆中的小分子代谢产物，对代谢综合征气滞湿阻证及脾气虚证大鼠模型的血浆样品进行研究，对代谢指纹图谱进行主成分分析和偏最小二乘判别分析法分析，初步选出β-羟丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸、丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、N-乙酰基-D-葡萄糖胺等特征代谢产物，证实代谢综合征气滞湿阻证与脾气虚证的发生可能与三大代谢的紊乱相关，提示这些小分子代谢产物可能是代谢综合征气滞湿阻证以及脾气虚证的物质基础。

3.2 基于临床的中医代谢组学证候研究 传统中医的临床诊断，采用“望闻问切”采集病史，具有一定主觀性，同时代谢组学临床试验不能排除外周环境及患者生活习惯导致的干扰。但是，临床试验更贴近临床实际，实验数据更能体现人类生理病理特点，因此代谢组学的临床证候研究近几年发展迅速，并且取得一定成果。

苏君梅等[19]运用气质谱联用法对糖尿病气阴两虚证患者的尿液样本进行分析，发现气阴两虚证与非气阴两虚证患者的尿液代谢物存在明显差异。在糖尿病患者的尿液中，2型糖尿病组D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、甘氨酸、2，3，4-三羟基丁酸、肌醇、尿素含量均升高，马尿酸含量降低，气阴两虚组中，甘氨酸、D-半乳糖比非气阴两虚组偏高，木糖醇、马尿酸含量偏低，初步证实2型糖尿病气阴两虚证的中医证型物质基础。

施旭光等[20]运用磁共振氢谱检测法对慢性浅表性胃炎脾气虚证患者的尿液进行代谢组学研究，使用主成分分析法及偏最小二乘判别分析法对数据进行分析，得出10种生物标记物，提示脾气虚证患者存在糖、脂、氨基酸代谢和核酸代谢异常，证实补中益气汤治疗慢性浅表性胃炎脾气虚证可能与提高机体能量代谢、调整肠道菌群代谢相关。

马俊杰等[21]运用气相色谱-质谱联用法对120例非小细胞肺癌患者及60例肺部良性结节患者的活检组织进行代谢组学研究，发现16种肺癌与肺部良性结节组织之间的显著差异性化合物；同时对非小细胞肺癌组进行进一步的研究，发现虚证组与实证组患者肿瘤组织中代谢物成分有显著差异，得出柠檬酸、丙酮酸及缬氨酸等10个差异性代谢物，从而认识到肺小细胞癌虚证患者肿瘤能量、糖、脂代谢更为活跃，同时其机体免疫功能较差，肿瘤指标增值速度更快。

程鹏等[22]运用气质谱联用法研究冠心病痰浊证和气虚证的中医分型及其物质基础，将色谱图和质谱库进行匹配鉴定，最终得到46个代谢物。经过MCTree分析结果显示，痰浊证及气虚证患者在代谢物上差异有统计学意义（P < 0.05），丝氨酸、缬氨酸和2-羟基丙酸为区别这2种证型的生物标记物。

陈夏等[23-24]在前期研究的基础上，通过对冠心病心血瘀阻证患者的血浆及尿液代谢谱进行的深入分析，寻找心血瘀阻证患者的代谢组学通路，研究发现患者血浆中9个特异性代谢物，涉及15条代谢途径，其中糖酵解和糖异生、丙酸代谢以及脂肪酸合成通路具有重要意义。在对尿液代谢谱的研究中发现了6个差异性代谢产物共参与了10条代谢路径，其中半乳糖代谢和酮体的合成和降解通路对疾病和证型的形成具有明显作用。

4 问题与展望

近几年，代谢组学作为中医药走向现代化和国际化的重要手段，为中医的证候研究带来新的方向，取得了些许成果和进展，但也存在一些不足。①当前代谢组学研究仍处于模式识别和生物标记物识别的层次，距离全面的代谢组学研究目标还有一定差距，如何专业、系统且全面地分析所有能采集到的图谱信息数据，并且在研究中涵盖所有差异性部分是促进代谢组学突破性发展的关键[25]。②在中医证型的临床研究方面，证的诊断标准不统一，中医证型尚无准确且公认的诊断标准，这对病例的纳入造成一定困难；其次，目前临床研究的病例数目普遍较少，研究结果不一定具有普遍的代表性，同时缺乏代谢物表达图谱数据平台，为数据分析带来一定困难。③在实验研究方面，许多疾病的造模尚未有公认的方式，证型的造模更是缺乏权威认定，同时中医证型的判断需要“望闻问切”四诊合参，这在对动物证型进行诊断时往往做不到，中医证型的复制并不是简单的将各种外界病因相叠加，还涉及正气与病邪的关系、体质以及情志等多方面因素影响，所以动物证型模型的复制往往不同于实际的临床证型。④由于目前对生物体代谢物认识的局限性，许多代谢物在代谢库中无法查询，或者对相关代谢物的特性及生理病理意义认识尚不全面，从而制约了对证型的形成机制、病理特点的分析研究。⑤尽管在代谢组学的临床研究中发现了一些具有一定代表性的代谢物，但由于检测手段的普及性不够，并且缺乏大样本的临床证实，因此在诊断证型、评价疗效的临床运用方面尚有较大距离。此外，在整个疾病过程中，证型会随着疾病的发展而变化，并不是一成不变的，而在动物实验中，往往难以对证型变化进行控制和把握。

隨着各种高分辨、高通量和高灵敏度分析技术的产生，各种多元统计方法的更新和代谢数据库的不断完善，代谢组学这门新兴学科在不断地发展和进步。中医药正走向现代化和国际化，建立行业认可的诊断标准是当务之急，明确的诊断标准是中医证候研究的基础。同时对于证候动物模型复制的准确性和可靠性需进一步提高，如何将中医临床辨证思路与动物模型的复制相衔接值得更深入的研究。只有中医理论自身与研究手段共同进步与发展，才能更好推动中医药的现代化与国际化。

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收稿日期：2015-08-11；修回日期：2015-09-24