NF—κB、IL—17与胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜细胞及血清表达的关系

马武开 陆道敏 姚血明 黄颖 唐芳 周静

【摘 要】目的：观察核转录因子-κB（NF-κB）、白细胞介素-17（IL-17）在胶原诱导性关节炎（CIA）模型大鼠关节滑膜细胞的表达，探讨其与炎症的关系。方法：将24只6周龄雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组和模型对照组，每组12只。模型对照组建立CIA大鼠模型，采用足趾容积、关节炎指数（AI）评价关节炎症，酶联免疫吸附法检测IL-17，免疫印迹法检测滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50和IκBα的表达。结果：CIA模型大鼠足趾容积大于空白对照组，模型对照组大鼠于造模后第14天开始，关节炎指数积分逐渐增加，第28天左右达到高峰。模型对照组大鼠IL-17表达高于空白对照组（P < 0.01），

NF-κB/P65、NF-κB/P50和IκBα蛋白活性明显高于空白对照组（P < 0.05或P < 0.01）。结论：CIA模型大鼠滑膜细胞NF-κB活性蛋白增高，IL-17呈高表达，可能与炎症相关。

【关键词】 关节炎，类风湿；胶原诱导性关节炎；滑膜细胞；血清；NF-κB；IL-17；大鼠

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种原因不明的自身免疫性疾病，其确切的发病机制尚不清楚。核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，

NF-κB）是一种广泛存在于真核细胞的核转录因子，NF-κB作为信号转导的枢纽，在肿瘤、哮喘及RA的发生发展中起重要作用[1-3]。NF-κB参与炎症、免疫反应、细胞凋亡及细胞周期控制与分化，并在RA发病中起关键作用。白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）是一种促炎症细胞因子，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞等产生多种促炎介质，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀，IL-17与其他细胞因子如白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等相互

作用，导致RA病变进展[4]。本实验通过建立Ⅱ型胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，

CIA）大鼠模型，观察CIA模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB蛋白活性及血清IL-17的水平，探讨NF-κB、

IL-17与CIA模型大鼠关节炎症的关系。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康清洁级雌性Wistar大鼠24只，

6周龄，体质量（200±20）g，购于重庆滕鑫生物技术有限公司[动物许可证号SCXK（渝）20070006]，遵守实验动物福利伦理原则。

1.2 主要试剂 牛Ⅱ型胶原（美国Sigma公司，C7806）；不完全弗氏佐剂（美国Sigma公司，F5881）；兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体（美国millipore公司，NG1861049）；兔抗大鼠NF-KB（p105/p50）单克隆抗体（美国Epitomics公司）；兔抗大鼠IκBα单克隆抗体（美国Epitomics公司）；IL-17 ELISA试剂盒（美国ADL公司，RT110371）。

1.3 主要仪器 LD25-2自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；YLS-7B大鼠足趾容积测量仪（淮北正华生物仪器设备有限公司，校零误差≤±5 μL）；

高速分散均质匀浆机（A200-12G）；台式高速离心机（TGL-16M型）；低温冰箱（型号-86-

120WA），电泳仪（DYY-7C型）；紫外分光光度计（日本岛津）；凝胶成像分析系统（美国GE Healthcare公司）；电泳仪（江苏常州无线电元件四厂）；LY70倒置显微镜（日本Olypmpus公司）；酶联免疫检测仪（上海同舸工贸有限公司，DG5033A）；洗板机（130011，AT-828）。

2 方 法

2.1 动物模型制备及分组 将24只Wistar大鼠随机分为空白对照组和模型对照组，每组12只，模型对照组大鼠按照文献[5]建立CIA模型。将牛Ⅱ型胶原10 mg溶于5 mL成质量分数为0.1 mol·L-1

的醋酸溶液中，配制成质量分数为2 mg·mL-1的胶原溶液，使之充分混匀，置于4 ℃冰箱过夜。再与等体积弗氏完全佐剂在冰浴中充分乳化，配制成1 mg·mL-1的胶原乳剂。于大鼠尾根部皮下多点注射胶原乳剂0.5 mL，第7天再同法予胶原乳剂0.3 mL加强免疫。空白对照组在实验过程中不做任何处理。两组大鼠自由摄食、饮水，温度控制在18～22 ℃，湿度控制在65%～80%。

2.2 关节炎指数（AI） 致炎第7天按AI评分标准[6]评价关节炎程度，无关节红肿记0分，趾关节红肿记1分，趾关节和足跖肿胀记2分，踝关节以下的足爪肿胀记3分，踝关节在内的全部足爪肿胀记4分。每个关节最高分为4分，4个关节累计积分即为每只大鼠的AI。分别计算各组大鼠造模前及造模后7，14，21，28 d时的AI。28 d后断头处死大鼠取血，离心取上清，剥离双侧后膝关节滑膜用于实验指标检测。

2.3 足趾容积 造模第1天用大鼠足趾容积测量仪测量每组大鼠前后足趾容积，分别于第14，21，28天测量足趾容积，并做好记录。

2.4 关节滑膜病理切片 取双侧后膝关节滑膜及软骨，于质量分数4%多聚甲醛液固定，常规脱钙、脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，在光学显微镜下观察关节滑膜及周围组织的病理变化。

2.5 血清IL-17检测 采用ELISA法，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，先加入标准品和待测样品，设置阴性对照；37 ℃ 反应30 min温育，后洗板5次；加入酶标试剂，37 ℃ 反应，洗板5次；加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液，上酶标检测OD值（吸光度），重复3次，取平均值。

2.6 NF-κB检测 采用Western blot法，将关节滑膜组织低温匀浆后加蛋白裂解液，置冰上40 min，于4 ℃置12 000 r·min-1离心机离心10 min，取上清。以BSA为标准，用Bradford 法对上清进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，质量分数10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h；一抗4 ℃过夜。用不含抗体TBS-T液孵育作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶（AP） 标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h；洗膜后，用Western blot印迹观察，用图像分析测定各带吸光度（A）值作定量分析。NF-κB检测过程中，匀浆液中需加蛋白保护剂。

2.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 两组一般情况 实验中，12只模型大鼠造模成功10只。模型对照组大鼠于免疫后第14天左右开始出现不同程度的关节红肿；随着免疫时间进

展，模型对照组大鼠关节肿胀程度逐渐加重，运动量明显减少，出现直立困难，活动障碍，毛发晦暗无泽，食欲减少，体质量减轻，至第28天关节肿胀程度达到高峰。见图1。

3.2 两组血清IL-17比较 ELISA结果显示，空白对照组IL-17为（19.54±5.76）ng·mL-1，模型对照组为（36.71±9.12）ng·mL-1，模型对照组大鼠血清IL-17表达高于空白对照组（P < 0.01）。

3.3 两组大鼠关节滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比较 免疫蛋白印迹结果分析显示，与空白对照组比较，模型对照组大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值明显升高

（P < 0.05或P < 0.01）。说明模型大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα的蛋白活性呈高表达。见表1。

表1 两组大鼠关节滑膜NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα灰度值比较 组别 动物数

（只） NF-κB/P65 NF-κB/P50 IκBα

空白对照组 12 3.42±1.75 3.43±1.52 4.83±1.20

模型对照组 10 6.45±2.671） 6.37±1.892） 6.70±2.252）

注 与空白对照组比较，1）P < 0.05，2）P < 0.01

3.4 两组AI评分结果比较 模型对照组大鼠致炎后2周开始出现不同程度的关节红肿，4周后肿胀达高峰，部分关节变形。见表2。

3.5 两组各时间点足趾关节容积变化比较 随着免疫时间的延长，模型对照组大鼠足趾关节肿胀逐渐加重，足趾容积增加。见表3。

3.6 两组关节滑膜形态学变化比较 病理染色结果显示，空白对照组大鼠膝关节滑膜未见明显的血管扩张、增生及炎细胞浸润。模型对照组滑膜组织可见血管增生、滑膜增厚、炎细胞浸润、水肿，软组织增生。见图2。

4 讨 论

RA是一种多细胞因子参与的侵蚀性滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，NF-κB信号通路在细胞因子的激活过程中起着“开关”作用。在静息状态下，NF-κB多以异源二聚体存在，并与抑制物IκB结合成三聚体以无活性方式存在于细胞质中。NF-κB的活化与调节是一个复杂而精细的过程。生理状态下NF-κB活化受到机体内在机制调控，参与多种生命过程。在哺乳动物细胞中最常见的是NF-κB p65与p50结合形成p65/p50二聚体，在静息状态下，胞浆中NF-κB与抑制蛋白IκB结合形成复合体，覆盖NF-κB核定位信号，使NF-κB锚定于胞质中，不能发挥基因转录调控作用。IκB亚基IκBα与NF-κB二聚体上的两个核定位序列中的一个结合，使非活性状态的NF-κB-IκBα进入细胞核。同时，IκBα蛋白氨基末端的出核信号（nuclear-export

signal，NES）使NF-κB-IκBα复合物移出胞核，NF-κB-IκBα复合物在核内与核外处于动态平衡中[7]。IκBα启动子上有一个NF-κB反应元件，对刺激比较敏感，能够快速被降解与再合成[8]；当细胞受到TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等外源性刺激，IκB被降解，NF-κB异二聚体移位到胞核内，与DNA上的κB基序列相结合从而发挥转录调控作用。NF-κB参与炎症、免疫反应、细胞凋亡及细胞周期控制与分化，并在RA发病中起关键作用。RA滑膜细胞中TNF-α和IL-1β等通过一系列级联反应激活IKK激酶复合体。IκB在IKK激酶复合体作用下被降解，释放NF-κB，从而调控各种炎症介质基因（如TNF-α与IL-1β）的表达。炎症因子与活化的NF-κB形成正相调控循环，两者构成的正反馈机制使RA关节滑膜炎症反应和骨质破坏得以维持与进展[9-10]。研究表明，NF-κB在CIA大鼠滑膜组织中表达升高，且主要于细胞核中表达[11]。NF-κB的调控与活化在RA的病理变化中占有重要地位。本研究结果表明，NF-κB的活性在CIA大鼠关节致炎后明显增高，表明NF-κB参与CIA炎症的调控。

IL-17是一种前炎性促炎症细胞因子，主要由Thl7细胞产生，具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞能力，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质IL-1、IL-6、TNF-α、一氧化氮合酶2、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1、生长调节因子等多种细胞因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀。IL-17主要通过其受体（IL-17R）特异性结合，发挥促炎症反应、免疫应答等多种功能。在RA的发病过程中，IL-17与其他细胞因子如IL-1、TNF-α等相互作用，导致RA病变进展[4]。本研究结果显示，CIA模型大鼠血清IL-17明显高于空白对照组，NF-κB的活性在CIA大鼠关节致炎后明显增高，其血清IL-17的表达升高，说明两者可能在RA的发生、发展中相互作用、相互调节，IκBα亦呈升高趋势。研究结果的可靠性尚需进一步验证。

5 参考文献

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收稿日期：2014-09-07；修回日期：2014-12-26