外周血结核T细胞检测在肺结核涂阴患者中的临床研究

黄其俊 宋大伟 吴坚敏 汪强

[摘要] 目的 探讨外周血结核T细胞检测在肺结核涂阴患者诊断中的临床价值。 方法 将研究对象分为两组：肺结核组96例，其中涂阴肺结核71例，其他肺部疾病组60例。所有患者分别进行外周血结核T细胞的γ-干扰素释放试验（TB-IGRA）、血清结核抗体和结核菌素试验（PPD试验）。 结果TB-IGRA试验、结核抗体和PPD试验在涂阴肺结核组与其他肺部疾病组阳性率比较，差异有统计学意义（P均<0.01）；TB-IGRA试验在肺结核涂阴组与涂阳组中定性与定量结果比较，差异无统计学意义（P均>0.05），其在涂阴肺结核诊断中敏感性和特异性分别是90.1%和91.7%，阳性预测值、阴性预测值分别是92.8%和88.7%，与结核抗体和PPD试验比较，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 外周血结核T细胞检测在涂阴肺结核的诊断上具有敏感性和特异性高、结果客观等优点，有助于对涂阴肺结核的患者进行鉴别诊断，以避免误诊误治。

[关键词] 痰涂片；肺结核；诊断；外周血结核感染T细胞

[中图分类号] R521 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）28-0099-04

结核病是严重危害人们健康的呼吸道传染病，我国结核病发病人数居世界第二位[1]。快速准确地检测结核分枝杆菌的感染是控制结核病流行的关键[2]。细菌学检查是诊断肺结核的金标准，但是肺结核涂阴患者的诊断在临床上常由于痰涂片检测阴性、痰培养方法检测周期长和敏感性低等问题，给临床诊断带来一定的困难。影像学、结核菌素试验、结核抗体和分子诊断技术均存在一定的局限性[3]，因此寻求新方法对肺结核进行早期诊断具有重要的临床意义。结核分枝杆菌是结核病的主要致病原，属于胞内感染菌，诱发反应是以T细胞为主的细胞免疫[4]。近年来，建立在以T细胞为基础的结核分枝杆菌特异性γ-干扰素释放试验目前已列入欧美等国家结核病诊疗指南，以协助诊断结核感染的存在[5，6]。本试验主要探讨外周血结核T细胞检测在肺结核涂阴患者诊断中的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

选取2013年7月～2015年3月在我院感染科或呼吸科诊治的患者。入选标准：①患者有咳痰、咳嗽等呼吸道症状，CT检查或X片显示肺部有阴影；②年龄18～60岁，性别不限。排除标准：①妊娠；②SLE、风湿等自身免疫性疾病；③艾滋病；④器官移植、使用免疫抑制剂等患者。肺结核诊断主要依据痰涂片检查、影像学资料和临床症状并参照肺结核的诊断标准排除其他疾病后确诊[7]。涂阴肺结核的诊断符合中华结核病诊治指南。其他肺部疾病患者通过血常规、痰培养、胸片等检查确诊或抗炎治疗排除肺结核者，如肺炎、肺部肿瘤、支气管扩张等。将入选患者分为两组：肺结核组96例（含涂阳25例和涂阴71例），其中男59例，女37例，平均年齡（45.2±13.1）岁；其他肺部疾病组60例，包括肺炎34例，肺气肿9例，肺癌11例，慢性阻塞性肺疾病6例，其中男37例，女23例，平均年龄（46.9±14.5）岁。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

入选患者分别检查痰涂片（抗酸染色）、外周血结核T细胞检测、结核抗体（胶体金法）和PPD试验。

1.2.1 外周血结核T细胞检测 体外释放酶联免疫法，北京万泰生物公司试剂盒。（1）IFN-γ的体外释放：①在2 h内将全血标本轻柔颠倒混匀3～5次后分装到N（本底对照）、T（测试）、P（阳性对照）三种培养管中，1 mL/管。②培养：将培养管轻柔颠倒混匀5次后迅速置入37℃培养（22±2）h，培养过程中须保持培养管直立。③离心：培养后的培养管以（3000～5000） r/min离心10 min，取血浆进行ELISA检测，注意不可吸到细胞层。（2）IFN-γ的定量检测：采用ELISA法，以校准品（12.5 pg/mL、25 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、400 pg/mL）的抗原含量及其对应的吸光度均值制得标准曲线，求出线性回归方程，将N、T、P三种培养管培养后血浆标本的吸光度值分别代入回归方程，求得三种管中血浆标本相应的IFN-γ含量。（3）IFN-γ的阳性判定：按照试剂盒说明书进行，以T管与N管含量差值即（T-N）≥14，并且≥N/4，结果判定为阳性[8]。

1.2.2 结核菌素试验 采用成都生物制品研究所生产的试剂（BCG-PPD，50 IU/mL）。①以PPD试剂0.1 mL（5IU）于左前臂内侧中上1/3处皮内注射，使局部形成皮丘。②经72 h后观察注射部位硬结平均直径[（横径+纵径）/2）]。硬结<5 mm为阴性，5～9 mm为弱阳性，10～19 mm为阳性反应，提示结核杆菌感染，≥20 mm（或<20 mm但有水疱或坏死时）为强阳性[9]。本研究以硬结直径≥10 mm时，结果判定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TB-IGRA试验、结核抗体和PPD试验对涂阴肺结核诊断的评价指标分析

由公式：灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）可知，在涂阴肺结核组中TB-IGRA试验敏感性为90.1%[64/（64+7）]，与血清结核抗体和PPD试验的敏感性相比，差异均有统计学意义（χ2=16.7、8.7，P<0.01）。TB-IGRA试验在涂阴肺结核组的敏感性远远高于在其他肺部疾病组中的敏感性（χ2=87.3，P<0.01）。由公式：特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）可知：TB-IGRA试验在涂阴肺结核诊断中的特异性为91.7%[55/（55+5）]，明显高于结核抗体（73.3%）和PPD试验（68.3%），差异有统计学意义（χ2=7.0、10.2，P<0.01）。见表1。TB-IGRA试验对涂阴肺结核诊断的阳性预测值为92.8%，与血清结核抗体、PPD试验相比，差异均有统计学意义（χ2=9.9、9.2，P<0.01）。TB-IGRA试验对涂阴肺结核诊断的阴性预测值为88.7%，与血清结核抗体和PPD试验相比，差异有统计学意义（χ2=13.1、9.0，P<0.01）。

表1 TB-IGRA试验、结核抗体和PPD试验对涂阴肺结核诊断的评价指标比较

2.2 肺结核患者涂阴、涂阳组TB-IGRA试验定性与定量结果比较

TB-IGRA试验在肺结核涂阴、涂阳两组中的敏感性比较，差异无统计学意义（χ2=0.075，P>0.05），两组中的定量结果比较也无显著性差异（t=0.59，P>0.05），见表2。

表2 肺结核患者涂阴、涂阳组TB-IGRA試验定性与定量结果比较

3 讨论

肺结核是一种常见且难以进行病原学诊断的疾病，防治形势不容乐观[10]。对于肺结核患者进行早期诊断和治疗是控制结核病播散的重要环节，也是改善患者预后的关键。痰涂片抗酸染色比培养快，能在早期为呼吸道感染的诊断和治疗提供重要信息，但无法区分死活菌及非结核分枝杆菌，受制于痰液中分枝杆菌的数量，故敏感性较低[11]，本研究阳性率仅为26.0%（25/96），使漏检人数显著增加。肺结核常表现为午后低热、纳差、乏力、盗汗、消瘦等，呼吸道方面有咯血、咳痰、咳嗽、呼吸困难和不同程度胸闷、胸痛等症状。目前，诊断痰菌涂阴的肺结核患者主要依靠典型的临床症状、PPD试验或经纤维支气管镜的肺组织活检、肺部影像检查的特征性改变等，但临床上仍有部分患者缺乏典型的临床症状和肺部影像学改变、PPD试验呈阴性或弱阳性、不愿接受纤支镜检查或病情重不能耐受者，因此给涂阴肺结核的诊断带来困扰。

我国临床实验室开展的结核病相关检查有皮肤结核菌素试验、血清结核抗体、痰涂片找抗酸杆菌和结核杆菌培养等，这些方法在诊断敏感性和特异性等方面均存在一些不足。结核菌素试验是基于Ⅳ型变态反应的一种皮肤试验，用来检测机体有无感染过结核杆菌，凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力，当再次遇到少量的结核杆菌或结核菌素时，致敏T淋巴细胞受相同抗原再次刺激会释放出多种可溶性淋巴因子，导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚，导致浸润，约在48～72 h内，局部出现红肿硬结的阳性反应，若受试者未感染过结核杆菌，则注射局部无变态反应发生[12]，但该试验容易受到交叉反应、机体免疫力状况等影响[13]，PPD试验阴性还可见于以下情况：结核菌感染后需4～8周有变态反应充分建立，在变态反应前期，PPD试验常阴性；严重结核病和各种危重患者对结核菌素无反应或弱阳性，是由于人体免疫力连同变态反应暂时受到抑制的结果；其他如淋巴细胞免疫系统缺陷（如白血病、淋巴瘤、艾滋病等）患者和老年人的结核菌素反应也常为阴性。硬结直径为5～9 mm不能排除因接种卡介苗所致，本研究即使以硬结直径10 mm作为诊断临界值，特异性仅为68.3%。血清结核抗体检测也会因接种卡介苗或其他分枝杆菌感染等影响而出现假阳性，而在免疫力低下患者，不能产生足量的结核抗体导致假阴性结果[14]。外周血结核T细胞的γ-干扰素释放试验是结核病诊断领域的重要进展，建立在以T细胞为基础的体外IFN-γ测定方法，从而评估患者的T淋巴细胞是否被结核分枝杆菌特异性抗原致敏。本试验试剂盒采用体外释放酶联免疫法原理衡量特异性抗原介导的细胞免疫反应强度。主要使用两种特异性抗原，分别是ESAT-6（早期分泌抗原-6）和CFP-10（培养滤出液蛋白-10），刺激结核分枝杆菌感染者特异性T淋巴细胞并使其增殖，释放γ-干扰素。微孔条上预包被的IFN-γ抗体可与标本中的IFN-γ结合，再加入酶标试剂进行二次混育。当标本中存在IFN-γ时，将形成“包被抗体-IFN-γ-酶标抗体”复合物，然后进行ELISA显色，通过酶标仪检测吸光度，计算标本中的IFN-γ含量，从而判断该患者是否具有针对结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应，可用于结核分枝杆菌潜伏感染或活动感染的辅助诊断。本试剂盒采用的致病性结核分枝杆菌有卡介苗、其他分枝杆菌没有的缺失区域1（RD1）中两种基因的重组抗原[15，16]，因此其结果不受卡介苗接种和非结核分枝杆菌的影响，国内相关研究结果显示该试验对结核感染有较高的诊断价值[17-20]。由表1可知，TB-IGRA试验对于涂阴肺结核诊断的敏感性（90.1%）、特异性（91.7%）均较高，阳性预测值为92.8%，阴性预测值为88.7%，与其他肺部疾病组相比存在显著性差异，与同组的PPD试验、血清结核抗体相比也存在显著性差异。同时发现TB-IGRA试验在肺结核涂阳、涂阴两组中灵敏度无显著性差异，因此在指导涂阴结核的诊断方面具有重要的临床意义。

综上所述，肺结核痰涂片菌阴性患者临床诊断有时较为困难，皮肤PPD试验和血清结核抗体因其较高的假阳性、假阴性，常可能造成临床的误诊和漏诊。外周血结核T细胞检测作为一种新的早期诊断结核感染的免疫学方法，对涂阴患者显示出非常高的敏感性和特异性，实验室检测操作简便，不需要特别仪器，IFN-γ含量结果客观，也不受确诊前的预防性和经验性等抗结核治疗的影响，对临床症状不典型、PPD试验诊断不明确、涂阴肺结核具有重要的临床价值。

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（收稿日期：2015-05-26）