Dyrk1B在宫颈癌组织中的表达及其临床意义

刘敏杰 方来福 胡萍萍 翁科娜 边佳 毛佳瑜

[摘要] 目的 探讨DyrklB在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。 方法 利用免疫组化检测DyrklB在60例宫颈癌组织、60例宫颈癌癌旁组织和60例正常宫颈组织中的表达，分析DyrklB在宫颈癌组织中的表达状况以及与宫颈癌临床参数的关系。 结果 Dyrk1B 在宫颈癌组织中的表达（60/60，100%）明显高于癌旁组织（26/40，65%）和正常宫颈组织（16/40，40%），三组间比较差异有统计学意义（χ2=88.21，P<0.01）。Dyrk1B的强阳性率与宫颈癌的组织学分化程度有明显相关性（P<0.05），与宫颈癌患者的年龄、临床分期和有无淋巴转移等无明显相关性（P>0.05）。 结论 DyrklB在宫颈癌中高表达，提示其可能参与了肿瘤的发生和发展，并有望成为宫颈癌早期诊断的标志物和治疗的靶基因。

[关键词] Mirk/Dyrk1B；宫颈癌；免疫组化

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）28-0001-03

Expression and clinical significance of Dyrk1B in cervical carcinoma

LIU Minjie1 FANG Laifu2 HU Pingping1 WENG Kena1 BIAN Jia1 MAO Jiayu1

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China；2.Department of Pathology，Yinzhou People`s Hospital of Ningbo City，Ningbo 315040，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of DyrklB in cervical cancer and its clinical significance. Methods Immunohistochemical methods were used to detect the expression levels of DryklB in 60 cases cervical carcinoma tissues，60 cases of cervical cancer adjacent tissues and 60 cases normal cervical tissues. DryklB expression in cervical carcinoma and relationship with clinical parameters of cervical carcinoma. Results The expression of Dyrk1B in cervical cancer tissues was significantly higher than that in cervical cancer adjacent tissues and normal cervical tissues，and there was statistical significance between the three groups（χ2=88.21，P<0.01）. There was a significant correlation between the strong positive rate of Dyrklb and degree of histological differentiation（P<0.05），but there was no correlation between the strong positive rate of Dyrklb and patients age，clinical stage and lymph node metastasis of cervical carcinoma（P>0.05）. Conclusion The expression level of Dyrk1b in cervical carcinoma tissues is high，which indicates that it may participate in the occurrence and development of cervical carcinoma ，and it may become a tumor marker for clinical early diagnosis and a new target gene for treatment of cervical carcinoma.

[Key words] Mirk/Dyrk1B；Cervical carcinoma；Immunohistoehemical

雙重特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1B（dual-specificity tyrosine-phosphorylation regulated kinase 1B，Dyrk1B；又称Mirk）属Minibrain Dyrk家族成员，是一种苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，该蛋白基因定位在人类19号染色体q12-13.11上，其功能是特异性磷酸化下游的双链酪氨酸[1]，是一种特异性的双链酪氨酸磷酸化激酶[2]，最初是从结肠癌细胞株[3]和人类睾丸组织[4]中分离出来的。DyrklB可在翻译过程中完成自身磷酸化，并同时有磷酸化其他丝氨酸、苏氨酸的能力[5]，研究证实，Dyrk1B在细胞转录、细胞周期及细胞凋亡的调节中发挥着重要的作用。通过血清饥饿诱导静止状态，同时通过siRNA等方法沉默Dyrk1B的表达，可减少多种肿瘤细胞系的集落形成，并增强化疗药物诱导的细胞凋亡。Dyrk1B 除在人类的脑组织及肌肉组织中有表达外，在大多数正常组织中呈低表达或不表达[6]，但在某些恶性肿瘤组织中呈高水平表达，如胰腺癌[7，8]、结肠癌[9]、肺癌[10，11]、卵巢癌[12-14]、横纹肌肉瘤[15]、前列腺癌[16]等。Dyrk1B在宫颈癌细胞中的表达水平未见报道，本研究旨在应用免疫组化方法检测宫颈癌组织、癌旁组织及正常宫颈组织中Dyrk1B的表达情况，探讨Dyrk1B与宫颈癌发生、发展、分化程度、侵袭的相关性及其临床意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集本院2013年1月～2014年8月宫颈癌手术切除标本60例，年龄25～67岁，平均（51.0±9.2）岁，中位年龄50岁。每例分别取一块癌组织、癌旁组织和正常宫颈组织进行免疫组化染色。宫颈浸润癌60例。宫颈癌按组织学分级分为：高分化24例，中分化20例， 低分化16 例； 按2000年FIGO临床分期分为Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期4例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移38例。所有患者术前及活检前均未接受化疗或放疗。所有标本的诊断数据均经病理证实， 并附有完整的临床病理资料。患者术前均未接受化疗或放疗。

1.2 试剂与方法

应用免疫组化S-P方法检测Dyrk1B蛋白的表达。Dyrk1B抗体购自英国abcam公司，SP试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。Dyrk1B检测实验步骤：①石蜡切片3～4 μm，65℃烤片过夜；②组织切片脱蜡、水化；③灭活内源性过氧化物酶（3%H2O2，10 min）；④用PBS冲洗3次，每次2 min；⑤抗原热修复（EDTA pH=9.0，20 min）；⑥蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，每次2 min；⑦正常封闭血清（羊血清工作液，室温下10 min）；⑧倾去血清加一抗室温1 h（稀释比Dyrk1B 1∶400）；⑨蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，每次2 min；⑩二抗，即用型广谱试剂盒，室温25 min；{11}蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，每次2 min；{12}DAB显色3～10 min（即用型DAB显色液，镜下控制）；{13}苏木素复染、蓝化；{14}切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片.具体操作过程严格按照说明进行。用已知睾丸和骨骼肌作阳性对照，应用PBS代替一抗作阴性对照，在每个蜡块标本的连续切片中选一张做HE染色，用于免疫组化阳性染色部位的对照判定和分析。

1.3 判定标准

Dyrk1B蛋白主要定位于胞质和胞核。随机选择10个高倍（×400）视野，根据阳性细胞百分率及显色深浅采用半定量积分法分级。评分标准如下[14]：（1）阳性细胞百分率：（a）无着色，0分；（b）<25%，1分；（c）25%～75%，2分；（d）>75%，3分。（2）顯色深浅：（a）不显色或显色不清为0分；（b）浅黄色为1分；（c）棕黄色为2分；（d）棕褐色为3分。以上两项相加最终评定结果，0～1分为阴性（-），2～4分为阳性（+），5～6分为强阳性（++）。

1.4 统计学方法

采用 SPSS 21.0统计学软件进行处理。校正χ2检验组间差异的显著性，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dyrk1B在宫颈癌组织不同部位的表达情况

Dyrk1B在宫颈癌癌组织（60/60，100%）、癌旁组织（26/40，65%）的表达水平较正常宫颈组织（16/40， 40%）明显升高，差异有高度统计学意义（χ2=88.21，P<0.01），见表1。Dyrk1B在正常宫颈组织、癌旁组织及宫颈癌组织中表达情况见图1、2、3。

表1 Dyrk1B在宫颈癌组织不同部位的表达情况

2.2 Dyrk1B表达与宫颈癌临床病理特征的关系

表2中可见宫颈癌中Dyrk1B的表达与年龄、有无淋巴结转移和TNM分期无关（P>0.05），与分化程度存在一定的关系（P<0.05）；Dyrk1B蛋白表达于所有的宫颈癌组织，但是宫颈癌的阳性强度随宫颈癌组织的病理分化程度的降低而升高，Dyrk1B蛋白在低分化宫颈癌组织的强阳性表达（16/16，100.0%）明显高于中分化组（13/20，65.0%）和高分化组（13/24， 54.2%），差异有统计学意义（χ2=9.960，P<0.05）。

表2 Dyrk1B蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌在全球女性肿瘤中的发病率占第3位、死亡率占第4位[17，18]，在发展中国家其发病率居第一位。研究报道全球每年新发宫颈癌例数约为46.5万，占妇女新发癌症病例15%，其中我国每年新病例有13.15万，约占总数的1/3。近年来，年轻妇女的宫颈癌发病率呈明显上升趋势，流行病学调查发现其与性生活紊乱、过早性生活、高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染、吸烟、经济状况低下、种族和地理环境等因素有关。宫颈癌的发生、发展是一个逐步演变、进展的复杂而连续的过程，与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控及细胞凋亡密切相关，其机制目前仍不明确。寻找并发现宫颈癌发生、发展过程中的相关敏感指标，对阻断宫颈癌癌前病变的发展，减少宫颈癌的发生，对临床早期诊断、早期治疗、判断转归，具有重要的指导意义。

本研究发现，宫颈癌中Dyrk1B蛋白的强阳性表达与患者年龄、临床分期以及淋巴结转移等无相关性（P>0.05），但其强阳性表达和宫颈癌组织病理分化程度有一定的相关性，低分化组（16/16， 100%）明显高于中分化组（13/20，65%）和高分化组（13/24，54.2%），三组比较差异有统计学意义（χ2=9.960，P<0.05）。Dyrk1B蛋白随着宫颈癌的病理分化程度降低而升高，提示Dyrk1B蛋白可能参与了宫颈癌的发生和发展，对宫颈癌的诊断和预后都有一定的价值。DyrklB的表达具有细胞依赖性，在正常组织细胞中趋向于细胞核内表达，调节细胞的存活与分化，而在肿瘤细胞中则多富集在细胞核周的胞浆内，参与肿瘤细胞抗凋亡活性的产生。当肿瘤细胞处于不利生长条件下时，DyrklB可使细胞进入暂时“休眠”状态的G0期，躲避应激环境损伤及化疗药物的“杀伤”，而该过程是可逆性的，当生长环境改善时G0期细胞又可重返细胞增殖周期，再次开始恶性增殖[19，20]，可见DyrkIB在肿瘤的复发与化疗耐药过程中可能起到了重要作用。

目前，已经有研究者将Dyrklb 作为抗肿瘤治疗靶点的研究对象，通过血清饥饿诱导静止状态，同时通过siRNA等方法沉默Dyrk1B的表达，可减少多种肿瘤细胞系的集落形成，并增强化疗药物诱导的细胞凋亡。有研究表明通过siRNA等方法沉默Dyrk1B的表达，不仅可大幅度削弱肿瘤软琼脂克隆形成和引起细胞内ROS水平的增加[21]，而且能增强化疗药物诱导的细胞凋亡，抑制胰腺癌在体内的增殖[22]，联合化疗药物对肿瘤患者进行治疗，最终评估其作为潜在的肿瘤标志物和肿瘤药物靶点的可能性。由于Dyrk1B与宫颈癌的诊断和预后都存在一定的关系，未来很可能是一个潜在的宫颈癌的肿瘤标志物和新的化疗药物靶点基因，为宫颈癌的诊断和治疗提供新的思路。

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（收稿日期：2015-06-05）