归脾汤对产后抑郁模型大鼠行为学影响的研究

崔艳超，唐启盛，赵瑞珍，杨歆科

产后抑郁（postpartum depression，PPD）是产褥期精神综合征中最常见的一种抑郁症状。通常在产后6周内出现症状，可持续至整个产褥期或更长时间［1］，表现为易激惹、恐怖、沮丧以及对自身和婴儿健康过度担心。产妇常失去生活自理和照顾婴儿能力，甚至做出伤害婴儿的行为或自杀［2］。国外使用爱登堡产后抑郁量表（EDPS）所调查的产后抑郁发生率为3.5%～33%［3］。国内报道各地区发病率存在差异，张小松等［4］研究产后6 个月产后抑郁患病率为5.7%，上海市发病率为8.0%～10.7%［5］，南京市为23.25%［6］，但多数报道认为产后抑郁目前的发病率呈升高趋势。目前西医在产后抑郁症的治疗方面存在药物通过母乳被婴儿吸收的危险，患者的接受度较差，而传统中医药在本病的治疗方面有疗效显著，毒副反应小、依赖性少等优势。归脾汤是中医临床治疗产后抑郁症常用的方剂之一。本研究通过构建产后抑郁模型大鼠，研究归脾汤对大鼠行为学的影响，旨在初步探讨归脾汤对治疗产后抑郁症模型大鼠的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雌性SD 大鼠，SPF级，体重200g±20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2006－2009。适应性喂养一周，光照节律12L／12D（06：00～18：00光照），室温（18±2）℃，相对湿度60%～70%，实验过程中保持安静，不限食水（术前禁食，蔗糖水实验前禁水）。

1.2 药品与试剂 归脾汤（组成为黄芪15g，党参10 g，白术、茯苓、龙眼肉、酸枣仁、当归、远志各12g，枳壳9g，龙骨、生牡蛎各30g，甘草6g），由北京中医药大学第三附属医院购置，按照灌胃剂量煎药浓缩，生药浓度1.72g／mL，贮存于4 ℃冰箱中备用，用前加热。盐酸氟西汀胶囊Patheon France公司生产，礼来苏州制药公司分包装，批号0943A，按照成人用量7倍计算大鼠用量为2.33mg／（kg·d）［7］。临用时溶于蒸馏水，混匀，浓度为0.233g／L。造模用激素：苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号1007251）；黄体酮注射液（上海通用药业股份有限公司，批号110502）。高效液相色谱试剂：5－HT（美国Sigma公司，批号028K5152），内标物羟苯甲酸（美国Sigma公司，批号04429MO）免疫组织化学试剂：兔抗5－HT1AR 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号990682W）；即用型免疫组化试剂盒（兔）（福州迈新生物技术开发有限公司，批号1112019706）；二氨基联苯胺显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号11111030031）。

1.3 造模及动物分组

1.3.1 动物分组与处理 购入大鼠先适应性喂养1周（此期间常规喂养，保持环境安静，每日照明时间为7：00～19：00，形成昼夜规律），1周后所有动物进行敞箱测试（open－field test，OFT），根据评分结果筛选合格动物并随机分组，分为正常组、假手术组、模型组、归脾汤组、氟西汀组，共5组，每组均设处理后1周、4周两个不同观察时点。各组每个时点动物均为6只。

1.3.2 模型建立

1.3.2.1 去势手术操作 参照Galea等［8］报道方法制作，具体如下：10%水合氯醛（0.4mL／100g）腹腔注射麻醉，左侧位固定于手术台，选取脊柱旁开一横指、肋缘后一横指皮肤，局部备皮、消毒。自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口约1cm，切开皮肤，用圆头剪插入皮肤与肌肉之间，钝性剥离。扩张肌肉层，暴露内部组织，定位右侧子宫角，用镊子轻轻夹住周围脂肪组织将其拉出体外，沿子宫角向上找到输卵管及卵巢，结扎后摘除，将子宫体送回腹腔。观察切口无出血，于创口局部涂洒青霉素预防感染，后分别缝合肌肉、皮下脂肪层及表皮。同法行对侧卵巢摘除，术后将大鼠单独置于笼中恢复。假手术组手术操作步骤同上，但不切除双侧卵巢，仅摘取卵巢周围少许脂肪组织。

1.3.2.2 阴道涂片筛查 于卵巢切除手术完成后第2天进行阴道涂片检查，将用生理盐水浸湿的棉签插入动物阴道内，轻轻转动几下后取出，将粘有阴道脱落细胞的棉签在玻片上均匀涂抹。待玻片干燥后，在涂抹处滴加两滴美兰，固定15min，用纯水冲掉美兰。每日1次，连续5d，镜下观察大鼠5d内阴道分泌物的细胞学变化，判断大鼠是否存在动情周期的改变。有变化者表示卵巢未切除干净，激素水平正在恢复，剔除不用。

1.3.2.3 雌、孕激素注射 选取去势手术合格动物，前16d每日皮下注射雌二醇注射液0.1mL（2.5μg）、黄体酮注射液0.2mL（4mg），后7d每日注射雌二醇注射液0.1mL（50μg），以模拟大鼠“妊娠”状态下的激素分泌水平，第24天（即“产后”第2天）停止激素注射。正常组、假手术组动物前16d每日皮下注射芝麻油0.3mL，后7d每日注射芝麻油0.1mL。

1.3.3 药物干预 造模结束后进行药物干预，药物灌胃体积均为1mL／100g体重。中药组、西药组分别予归脾汤、盐酸氟西汀，正常组、假手术组、模型组给予等容量双蒸水。灌胃剂量根据动物每周体重变化进行调整，各组灌胃干预按要求分别于造模后1周、4周不同时点结束，进行相关行为学测试后处死取材。

1.4 行为学观察

1.4.1 糖水消耗测试 测试前禁水24h，后各组动物自由饮用1%的蔗糖水1h，计算每只动物的蔗糖水消耗量。蔗糖水饮用量＝测定前瓶重（g）－测定后瓶重（g）。糖水消耗试验体现大鼠对奖赏的快感反应。

1.4.2 旷场实验 自制OPEN－FIELD 敞箱，高40 cm，长和宽均80cm。四周箱壁为黑色，底面用黑线均匀划分为相等面积的25块方格。以动物穿越方格数作为水平活动的得分（以动物四爪均进入方格为准），以直立次数为垂直活动得分（两前肢离地为一次作为标准）。每只动物仅测定一次，每次3min。室内隔音，每次测试前保持敞箱内干净。旷场试验的水平活动反映了大鼠的运动活动性水平，垂直活动的多少则反映其兴趣高低。

1.4.3 强迫游泳测试 也称行为绝望实验或Porsolt实验。将大鼠置于水深（15～18）cm 的圆柱形透明容器（泳池）中，进行15min“前游泳”。然后将大鼠从泳池中取出、烘干，进行干预（药物或者治疗），干预后放回笼中饲养。“前游泳”应激24h后，将大鼠再次置于泳池中，进行5min“测试游泳”并录像。观测并记录游泳时间（大鼠在泳池内水平面上、泳池内四周游动的时间）、挣扎时间（包括动物俯冲、前肢拍打水面以及抓爬玻璃瓶壁的时间）、不动时间（累计动物在水中停止挣扎呈直立漂浮状态，或仅有偶尔的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间）。分析干预措施对大鼠行为的影响，推测其抗抑郁活性。

2 结 果

2.1 大鼠体重的变化 组间比较，除归脾汤组4周及氟西汀组4周外，模型组、归脾汤组和氟西汀组其余各时间点体重均较正常组升高（P＜0.05，P＜0.01）；归脾汤组1周、4周及氟西汀组各时点均较模型组升高（P＜0.05，P＜0.01）；归脾汤组和氟西汀组于各个时点比较均无统计学意义（P＞0.05）。组内比较，模型组、归脾汤组和氟西汀组体重均呈增加趋势，但模型组较归脾汤组、氟西汀组增长幅度明显缓慢，归脾汤组经药物干预后可达正常水平。模型组、归脾汤组和氟西汀组4周时较各自1周时体重水平显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。详见表1。

表1 不同处理大鼠体重差异比较 g

表1 不同处理大鼠体重差异比较 g

与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与本组1周时比较，5）P＜0.05，6）P＜0.01。

组别 n 1周 4周正常组6 281.17±12.45 315.08±20.03假手术组 6 279.17±14.30 313.46±17.31模型组 6 262.33±12.712） 278.75±17.662）5）氟西汀组 6 270.92±13.902）3） 302.29±16.631）3）6）归脾汤组 6 268.54±11.982）3） 305.29±17.894）6）

2.2 大鼠蔗糖水消耗量比较 组间比较，模型组、归脾汤组各个时点与氟西汀组1周时，蔗糖水消耗量较正常组、假手术组降低（P＜0.05，P＜0.01）；氟西汀组及归脾汤组4周时，较模型组均升高（P＜0.01）；归脾汤组4周时，较氟西汀组降低（P＜0.05）。组内比较，模型组蔗糖水消耗量呈逐渐下降趋势，而归脾汤组和氟西汀组趋势则相反。模型组4周时较其1周时消耗量显著降低；归脾汤组和氟西汀组4 周时，蔗糖水消耗水平均较其1周时消耗水平有所增加（P＜0.01，P＜0.05）。详见表2。

表2 不同处理大鼠蔗糖水消耗量比较g

表2 不同处理大鼠蔗糖水消耗量比较g

与正常组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与模型组比较，3）P＜0.01；与氟西汀组比较，4）P＜0.05；与本组1周时比较，5）P＜0.05，5）P＜0.01。

组别 n 1周 4周正常组6 16.08±7.91 17.04±3.47假手术组 6 16.79±4.87 18.67±3.54模型组 6 10.42±4.181） 6.33±2.932）5）氟西汀组 6 10.04±5.141） 16.63±3.833）5）归脾汤组 6 9.25±3.852） 14.38±3.891）3）4）6）

2.3 大鼠旷场实验得分比较

2.3.1 水平得分 组间比较，模型组、归脾汤组、氟西汀组各时点Open－Field水平得分均较正常组、假手术组降低（P＜0.05或P＜0.01）；归脾汤组、氟西汀组除1周外，其余各时间点均较模型组水平得分显著升高（P＜0.01），归脾汤组和氟西汀组之间各时点比较无统计学意义（P＞0.05）。组内比较，模型组、归脾汤组、氟西汀组Open－Field水平得分均呈升高趋势，且归脾汤组、氟西汀组升高幅度较模型组明显。模型组、归脾汤组和氟西汀组4周时，旷场实验水平得分均较其1周时显著升高（P＜0.01）。详见表3。

表3 不同处理大鼠旷场实验得分 分

表3 不同处理大鼠旷场实验得分 分

与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与本组1周比较，3）P＜0.05。

组别 n 1周 4周正常组6 75.17±15.58 81.54±14.66假手术组 6 81.42±20.03 77.13±15.20模型组 6 32.04±10.001） 40.29±8.311）3）氟西汀组 6 27.79±10.251） 55.63±12.821）2）3）归脾汤组 6 29.88±5.291） 60.25±8.131）2）3）

2.3.2 垂直得分 组间比较，模型组、归脾汤组、氟西汀组各时间点Open－Field垂直得分均较正常组、假手术组降低（P＜0.05或P＜0.01）；归脾汤组1周时及归脾汤组、氟西汀组4周时，均较模型组垂直得分升高（P＜0.05或P＜0.01）；归脾汤组、氟西汀组于各时点相比差异无统计学意义（P＞0.05）。组内比较，氟西汀组Open－Field 垂直得分均呈逐渐升高趋势，模型组、归脾汤组呈降低后又逐渐升高趋势。模型组、氟西汀组4周时较其1周时显著升高（P＜0.05）。详见表4。

表4 不同处理大鼠旷场实验垂直得分 分

表4 不同处理大鼠旷场实验垂直得分 分

与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01；与本组1周时比较，4）P＜0.05。

组别 n 1周 4周正常组6 17.79±4.63 20.67±5.62假手术组 6 18.88±4.38 21.42±5.02模型组 6 8.42±3.011） 10.58±3.671）4）氟西汀组 6 10.42±2.901） 14.46±3.811）3）4）归脾汤组 6 12.79±3.981）3） 13.54±4.171）2）

2.4 大鼠强迫游泳时间比较

2.4.1 不动时间 组间比较，模型组、归脾汤组、氟西汀组各时间点强迫游泳不动时间均较正常组、假手术组显著增高（P＜0.01）；归脾汤组、氟西汀组各时间点强迫游泳不动时间均较模型组显著降低（P＜0.05），归脾汤组与氟西汀组比较无统计学意义（P＞0.05）。组内比较，模型组强迫游泳不动时间呈明显增加后又逐渐减少趋势，归脾汤组、氟西汀组呈逐渐减少趋势。归脾汤组、氟西汀组4周时均较其1周时显著减少（P＜0.01）。详见表5。

表5 不同处理大鼠强迫游泳实验不动时间 s

表5 不同处理大鼠强迫游泳实验不动时间 s

与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01；与本组1周时比较，4）P＜0.01。

组别 n 1周 4周正常组6 63.71±13.94 68.17±18.87假手术组 6 71.46±13.45 74.38±17.98模型组 6 148.29±27.321） 152.88±20.101）氟归西脾汀汤组组 66 112140..9265±±2109..066911））23））9845..4466±±2212..820911））33））44））

2.4.2 挣扎时间 组间比较，模型组、归脾汤组、氟西汀组各时间点挣扎时间均较正常组、假手术组显著减少（P＜0.01）；归脾汤组、氟西汀组各时间点均较模型组显著增加（P＜0.01）；氟西汀组1周时较归脾汤组显著减少（P＜0.05）。组内比较，模型组FST 挣扎时间呈稍减少后逐渐增加，此后又迅速减少趋势，归脾汤组、氟西汀组则表现为逐渐增加后又降低。归脾汤组、氟西汀组4周时挣扎时间均较其1周时显著增加（P＜0.05）。详见表6。

表6 不同处理大鼠强迫游泳实验挣扎时间 s

表6 不同处理大鼠强迫游泳实验挣扎时间 s

与正常组比较1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与氟西汀组比较，3）P＜0.05；与本组1周时比较，4）P＜0.05。

组别 n 1周 4周正常组6 137.21±19.25 142.08±20.66假手术组 6 131.58±17.98 130.17±18.81模氟归型西脾组汀汤 组组 666 879793.. .339863±± ±111755...237295111）））22 ））3 ）11 811009...257909±±±121909...774787 111）））22））44））

2.4.3 游泳时间 组间比较，模型组4周时游泳时间较正常组、假手术组显著减少（P＜0.01）；归脾汤组、氟西汀组4周时，较模型组游泳时间显著延长（P＜0.05或P＜0.01）。组内比较，模型组FST 游泳时间呈降低又逐渐升高趋势，归脾汤组逐渐升高，但二者各时间点间均无统计意义（P＞0.05），氟西汀组随时间推移升高趋势较明显。详见表7。

表7 不同处理大鼠强迫游泳实验游泳时间 s

表7 不同处理大鼠强迫游泳实验游泳时间 s

与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

组别 n 1周 4周正常组6 99.08±24.03 89.75±28.81假手术组 6 96.96±20.12 95.46±25.60模型组 6 78.38±29.79 66.83±27.931）氟西汀组 6 87.67±29.52 95.04±31.132）归脾汤组 6 89.79±26.58 94.75±31.022）

3 讨 论

3.1 产后抑郁动物模型的评判 实验动物的抑郁征象往往可通过其表征及行为学的变化予以反映。有关产后抑郁症模型动物抑郁表现的评测，主要沿用抑郁症实验动物研究中的相关方法，包括一般表征的观察以及目前较为公认的诸如蔗糖水消耗、旷场实验、强迫游泳实验等行为学评测［9－12］。本实验中的动物一般表征显示，正常大鼠皮毛光泽度好，毛发梳理动作及自由活动较多，且对周围环境显现出极大的兴趣而时常进行探究，同时体重增长速度较快。模型大鼠经激素刺激妊娠后，激素突然停撤，于造模后1周时，即呈现毛发光泽暗淡、活动度下降、疲乏倦怠等状态，体重增长亦缓慢，其上述表征至4周时虽稍有改善，但较正常大鼠仍有明显差异。相关行为学结果表明，正常大鼠对蔗糖水饮用快感明显，消耗量较大；旷场实验水平及垂直活动均有较高评分；强迫游泳实验不动时间较短，主要表现为挣扎与游泳行为。模型动物蔗糖水消耗量则随时间推移而呈现逐渐减少趋势；旷场实验中水平及垂直活动评分明显下降；强迫游泳实验不动时间显著延长。而在经归脾汤或盐酸氟西汀干预后，模型大鼠在一般状况与行为学方面均有明显变化，至4周时已有显著改善。以上模型动物出现的各种表征及行为学方面的改变，显现出大鼠于造模后的明显抑郁状态，此充分证实激素刺激妊娠后的激素突然停撤模型制备方法的成功性，同时也显示出药物干预的有效性。

3.2 中医辨证论治产后抑郁症 产后抑郁症是指产妇产后出现的以落泪、悲伤、情绪不稳、罪恶感、厌食、睡眠障碍、注意力不集中和记忆困难、疲乏、易激惹等为特征的一种神经症状性抑郁。传统中医药并未有“产后抑郁”这一明确的病名，但多有产后情志异常的记载，并将其归入“郁证”的范畴。随着朝代的迁延，中医对产后抑郁症的认识和了解也有所不同，但综观古代医家对产后抑郁症的论治原则，皆以补虚、祛瘀为要旨，并逐步从单纯的补虚发展为补虚与祛瘀并重。现代中医对产后抑郁症辨证进一步研究和细化，认为该病与心、肝、脾、肾四脏相关，主要成因为产后气血亏虚，败血滞留成瘀，瘀血停积，败血攻心等，可分为血虚气弱证、败血停积证、心脾两虚证等不同证型，治疗措施也不尽相同。血虚气弱证可选用茯神散；败血停积证可选用调经散或芎归泻心汤，另包五灵脂冲服；心脾两虚证可选用归脾汤或养心汤［13，14］。本研究选用归脾汤考察其产后抑郁模型大鼠行为学的改善，结果证实归脾汤对大鼠体重、糖水消耗量、旷场实验和强迫游泳实验结果均有一定程度的改善和提高，说明归脾汤对治疗产后抑郁症临床表征有一定的改善作用，这与范彦蓉等［15］的临床研究报道结果相一致。归脾汤在治疗产后抑郁症方面的应用有待进一步推广和加强。

归脾汤在多个指标的改善方面，如体重、蔗糖水消耗、旷场实验垂直评分等，总体改善趋势较氟西汀明显，而随着药物干预的不断持续，4周时可显现出较氟西汀相对好的效果。由此表明，归脾汤对于产后抑郁症的持续改善作用优势利于长期服用，在疾病治疗早期可采取中西医结合的方式，以归脾汤与氟西汀联合给药效果更佳，但具体疗效还有待进一步研究。

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