载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的制备

闫彩凤，许春兰，宋晓丽*

(扬州大学a.临床医学院，江苏扬州 225001;b.化学化工学院，江苏扬州 225002)

载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的制备

闫彩凤a，许春兰b，宋晓丽b*

(扬州大学a.临床医学院，江苏扬州 225001;b.化学化工学院，江苏扬州 225002)

以聚乙二醇化壳聚糖(PEG-CS)为载体，首先通过乳化交联法得到聚乙二醇化壳聚糖微球，然后采用扩散填充法制备载胰岛素的聚乙二醇化壳聚糖微球.运用扫描电镜、圆二色谱、红外光谱和紫外光谱等方法进行表征，并研究载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的控制释放性能.结果表明，载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球具有良好的缓释作用，且释放出的胰岛素结构保持不变，有望实现胰岛素的口服给药.

聚乙二醇化壳聚糖;胰岛素;微球;控制释放

胰岛素是治疗糖尿病最有效的药物，目前普遍采取皮下或静脉给药的手段，但频繁注射易导致低血糖、皮下脂肪萎缩及顺应性差等问题，故理想方式应选择口服给药［1］.胰岛素属于蛋白质多肽类药物，口服使用时其生物利用度仅为0.5%，所以欲实现胰岛素的口服给药，必须寻求理想的释放载体以克服生理障碍或酶障碍［2］.

目前已研发的胰岛素口服制剂的载体材料主要有脂质体［3］、乳液［4］和肠衣［5］等，但均处于研究阶段，仍达不到临床应用的要求.生物可降解高分子［6］则因其良好的生物相容性和生物可降解性能而成为蛋白多肽类药物的理想释放载体材料.生物可降解高分子主要分为聚酯和聚糖两类.聚酯类高分子具有疏水性，它与亲水的胰岛素分子间生物相容性差，从而影响了载体对胰岛素的负载量［7］.壳聚糖是聚糖类高分子的典型代表，具有优良的生物亲和性，可增强蛋白多肽类药物的透膜能力和生物黏附性，促进了药物在生物体内的吸收［8-10］.由于壳聚糖的水溶性较差，仅能溶解于酸性介质，所以其衍生物成为研究的热点［11］.聚乙二醇化壳聚糖［12］具有亲水性高、生物相容性好且没有免疫原性等优点，因此常被用作水溶性药物的载体材料，但其应用于胰岛素口服给药的研究鲜有报道.本文拟以聚乙二醇化壳聚糖为载体材料，制备载胰岛素的聚乙二醇化壳聚糖微球，并探讨其释放性能，以期为胰岛素口服给药的研究提供参考.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1)试剂.壳聚糖(CS，相对分子质量500 000，脱乙酰度85%，连云港生物制剂有限责任公司，BR);端羧基聚乙二醇(PEG—COOH，相对分子质量2 000，东联化学股份有限公司，AR);醋酸，液体石蜡，司班-80，丙酮，石油醚，体积分数为25%的戊二醛溶液(国药集团化学试剂有限公司，AR);四甲基乙二胺盐酸盐，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(百灵威化学技术有限公司，BR);NN-羟基琥珀酰亚胺(北京伊诺凯科技有限公司，BR);40 U·mL－1胰岛素溶液(万邦医药有限公司);去离子水.

2）仪器.ALPHA2－4LD plus型冷冻干燥仪（德国CHRIST公司，德国）；Tensor 27型傅里叶红外光谱仪（德国Bruker公司，德国）；UV－2501型紫外分光光度计（日本岛津公司，日本）；J－810圆二色光谱仪（日本JASCO公司，日本）；S－4800Ⅱ场发射扫描电子显微镜（日本日立公司，日本）；Vario EL cube型元素分析仪（德国Elementar公司，德国）.

1.2 聚乙二醇化壳聚糖（PEG－CS）的合成

称取1 g壳聚糖溶解于6 m L体积分数为2%的醋酸中，经20 m L四甲基乙二胺盐酸盐稀释后转移至三口烧瓶，置于35℃恒温水浴中，调节体系p H为5，加入0.77 mg 1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亚胺盐酸盐和0.46 mg N－N－羟基琥珀酰亚胺，30 min后再加入4.2 mg端羧基聚乙二醇，搅拌下反应36 h，控制酸度为4～6.粗产物经透析4 d，冷冻干燥得PEG－CS.

1.3 载胰岛素PEG－CS微球的制备

称取一定量冻干的PEG－CS，在磁力搅拌下加水溶解，配制成10 g·L－1的PEG－CS溶液，待用.

向三口烧瓶中加入40 m L液体石蜡和0.2 g司班－80，搅拌15 min；取6.4 m L PEG－CS溶液和2 m L 40 U·m L－1胰岛素溶液，搅拌，混合均匀后转移至三口烧瓶中，继续搅拌30 min形成W／O型乳液，向其中逐滴加入3 m L体积分数为25%的戊二醛溶液，控制体系温度为2～8℃反应5 h.粗产物经离心分离后依次用石油醚、丙酮、蒸馏水洗涤数次，冷冻干燥后得到PEG－CS微球.

将30 mg冻干PEG－CS微球加入5 m L 40 U·m L－1的胰岛素溶液中，磁力搅拌2 d后滤去上层清液，粗产物经去离子水洗涤5次后置于4℃冰箱中干燥，制备得到载胰岛素PEG－CS微球.将洗涤液与上层清液混合，测定混合液中胰岛素的质量含量，计算微球的载药量.

1.4 载胰岛素PEG－CS微球的载药量测定

选择PBS缓冲溶液（0.01 mol·L－1磷酸氢二钠和0.01 mol·L－1磷酸二氢钠的混合溶液，p H＝6.8）作为模拟肠液，配制0.010，0.025，0.050，0.075，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500 U·m L－1的胰岛素溶液.采用UV－2501型紫外分光光度计测定波长为274 nm处各质量浓度胰岛素溶液的吸光度，绘制胰岛素溶液质量浓度－吸光强度标准曲线，计算微球的载药量：

1.5 载胰岛素PEG－CS微球的控制释放

称取25 mg干燥的载胰岛素PEG－CS微球，置于截留相对分子质量为50 000的透析袋中，向其中加入2 m L p H＝6.8的PBS缓冲溶液，然后转移至装有8 m L p H＝6.8的PBS缓冲溶液（释放介质）的离心管中，在37℃、转速为170 r·min－1的水浴摇床中释放30 h，并在该过程中设定时间进行多次取样（每次取出3 m L释放介质的同时须补充等体积的新鲜介质）.通过紫外分光光度计测定取出的释放介质在波长为274 nm处的吸光度，计算胰岛素的释放量并绘制其控制释放曲线.设定扫描范围为200～250 nm，采用光程差为1 mm的石英比色皿，在4℃下测定释放出的胰岛素的圆二色谱图.

1.6 表征与分析

1）PEG－CS的红外表征及取代度分析.充分研磨冻干的PEG－CS，采用KBr压片法制样，通过傅里叶红外光谱仪在波数为400～4 000 cm－1的扫描范围下进行红外表征.采用Vario EL cube型元素分析仪测定PEG－CS中碳、氢、氮元素的相对质量含量，以氮元素的质量含量为基准计算衍生物的取代度.

2）载胰岛素PEG－CS微球的形貌观察.对载胰岛素PEG－CS微球在真空条件下进行喷金处理后，采用S－4800Ⅱ场发射扫描电镜观察其形貌.

2 结果与讨论

2.1 PEG－CS的红外表征及取代度分析

图1为CS及PEG－CS的红外光谱图.由图1可见：对于PEG－CS图谱，在波数为1 626，1 519 cm－1处呈现出新的吸收峰，分别对应于酰胺Ⅰ谱带和酰胺Ⅱ谱带，说明CS中氨基与PEG—COOH中羧基已反应形成酰胺键；此外，在1 083 cm－1处醚键的C—O伸缩振动吸收峰的相对强度明显高于CS的，这是由于PEG—COOH结构中含有大量醚键所致.

通过元素分析法测定出CS中C，N，H元素的质量 含 量 分 别 为 39.270%，7.273%，6.906%；而PEG－CS中 C，N，H 元 素 的 质 量 含 量 分 别 为33.700%，6.075%，6.724%.由 此 可 见 PEG－CS 中N元素的质量含量明显低于CS中的，这是由于PEG—COOH中不含N元素，因此PEG－CS中N元素相对质量含量的降低进一步表明PEG—COOH已与CS发生反应并成功合成了PEG－CS.经计算，本文合成的PEG－CS中PEG的取代度为11.52%.

图1 样品的红外光谱图Fig.1 FT－IR of the sample

2.2 载胰岛素PEG－CS微球的形貌观察

图2为PEG－CS微球及载胰岛素PEG－CS微球的扫描电镜图.由图2可见，载药前后微球均呈球形或类球形，粒径约为150～250 nm，表明载药前后微球的粒径及形貌未发生明显变化.

图2 PEG－CS微球（a）及载胰岛素PEG－CS微球（b）的扫描电镜图Fig.2 FT－IR of the sample SEM of PEG－CS microspheres（a）and insulin－loaded PEG－CS microspheres（b）

2.3 微球的载药量及其控制释放性能

图3为胰岛素溶液的标准曲线.由图3可见，胰岛素溶液的吸光度随其质量浓度的升高而增大.经拟合，标准曲线的线性方程为A＝0.967 4C＋0.000 8，其中C为胰岛素的浓度，A为274 nm处胰岛素溶液的吸光强度，相关系数R2＝0.999 9，曲线呈现出良好的线性关系.进而根据标准曲线计算得出载胰岛素PEG－CS微球的载药量为0.35 U·mg－1.

图4为载胰岛素PEG－CS微球在模拟肠液（PBS缓冲溶液，p H＝6.8）中的控制释放曲线.由图4可知，随着释放时间的推移，载药微球释放出的胰岛素逐渐增多，经5 h能达到释放平衡，且最大释放率高于95%，表明PEG－CS微球对胰岛素具有良好的控制释放性能.

图3 胰岛素溶液的标准曲线Fig.3 Calibration curves of insulin solution

2.4 胰岛素的结构表征

图5为胰岛素标准溶液及载胰岛素PEG－CS微球释放液中胰岛素的圆二色谱图.由图5可见，2种溶液中的胰岛素在波长为208，222 nm附近均可出现负峰，分别对应于α－螺旋和β－折叠的特征峰，由此表明胰岛素在释放前后的结构未发生明显变化，进而推测其生物活性也保持不变.

图4 载胰岛素PEG－CS微球的控制释放曲线Fig.4 Controlled release profile of insulin－loaded PEG－CS microspheres

［1］KHAFAGY E S，MORISHITA M，ONUKI Y，et al.Current challenges in non－invasive insulin delivery systems：a comparative review［J］.Adv Drug Deliver Rev，2007，59：1521－1546.

［2］MUKHOPADHYAY P，MISHRA R，RANA D，et al.Strategies for effective oral insulin delivery with modified chitosan nanoparticles：a review［J］.Prog Polym Sci，2012，37：1457－1475.

［3］KIM J C，JO S M，JOO H H，et al.Development of self regulated insulin delivery system：glucose sensitive liposome［J］.J Biotechnol，2007，131（2）：48－52.

［4］YANG Xuan，FENG Lei，LI Changjiang，et al.Tranilast alleviates endothelial dysfunctions and insulin resistance via preserving glutathione peroxidase 1 in rats fed a high－fat emulsion［J］.J Pharmacol Sci，2014，124（1）：18－30.

［5］SONAJE K，CHEN Yijia，CHEN H L，et al.Enteric－coated capsules filled with freeze－dried chitosan／poly（γglutamic acid）nanoparticles for oral insulin delivery［J］.Biomaterials，2010，31（12）：3384－3394.

［6］HU Yong，JIANG Xiqun，DING Yin，et al.Preparation and drug release behaviors of nimodipine－loaded poly（caprolactone）－poly（ethylene oxide）－polylactide amphiphilic copolymer nanoparticles ［J］.Biomaterials，2003，24（13）：2395－2404.

［7］KOFUJI K，ITO T，MURATA Y，el al.Biodegradation and drug release of chitosan gel beads in subcutaneous air pouches of mice［J］.Biol Pharm Bull，2001，24（2）：205－208.

［8］NAGPAL K，SINGH S K，MISHRA D N.Chitosan nanoparticles：a promising system in novel drug delivery［J］.Chem Pharm Bull，2010，58（11）：1423－1430.

［9］LUEBEN H L，LEEUW B J，LABGENEŸER M W E，et al.Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery VI：carbomer and chitosan improve the intestinal absorption of the peptide drug buserelinInVivo［J］.Pharm Res，1996，13（11）：1668－1672.

［10］GAO Yang，HE Lin，KATSUMI H，et al.Improvement of intestinal absorption of insulin and water－soluble macromolecular compounds by chitosan oligomers in rats［J］.Int J Pharm，2008，359：70－78.

［11］ZHU Aiping，YUAN Lanhua，CHEN Tian，et al.Interactions betweenN－succinyl－chitosan and bovine serum albumin［J］.Carbohyd Polym，2007，69：363－370.

［12］BHATTARAIA N，RAMAYA H R，GUNN J，et al.PEG－grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release［J］.J Control Release，2005，103：609－624.

Synthesis of insulin－loaded PEG－CS microspheres

YAN Caifenga，XU Chunlanb，SONG Xiaolib＊

（a.Sch of Clin Med，Yangzhou Univ，Yangzhou 225001，China；b.Sch of Chem ＆Chem Engin，Yangzhou Univ，Yangzhou 225002，China）

The PEG－CS microspheres are prepared by emulsification cross－linking method.And then insulin is loaded into the microspheres by diffusion method.Scanning electron microscopy，circular dichroism，infrared spectroscopy and ultraviolet spectroscopy are selected to characterize the relevant properties of the microspheres.The controlled release of insulin from the microspheres is investigated.The results show that the insulin－loaded PEG－CS microspheres can be a controlled－release to liberate insulin with its original structure.Thus the PEG－CS microspheres are expected to achieve the oral administration of insulin.

polyethyleneglycol－chitosan；insulin；microsphere；controlled release

O 636.1

A

1007-824X(2015)03-0032-05

2015-01-09.* 联系人，E-mail:xlsong@yzu.edu.cn.

国家自然科学基金资助项目(21201149);江苏省自然科学基金资助项目(BK2012259);扬州市八大产业科技攻关项目(YZ2010083).

闫彩凤，许春兰，宋晓丽.载胰岛素聚乙二醇化壳聚糖微球的制备［J］.扬州大学学报(自然科学版)，2015，18(3):32-36.

（责任编辑 林 子）