胆固醇酯转移蛋白转基因家兔制作及生物学特性分析

高守翠，成大欣，赵四海，2，陈玉龙，王晓靖，白亮，范江霖，3，刘恩岐，2

(1.西安交通大学心血管研究中心脂代谢与动脉粥样硬化研究室，西安 710061;2.西安交通大学医学院实验动物中心，西安 710061;3.山梨大学医学部分子病理学系，日本 山梨 409－3898)

基因修饰动物模型是当今生物医学研究的主要工具，主要包括基因敲除和转基因动物模型。在研究候选基因在疾病发生中的作用及其分子机制时，往往需要改变其在体内的表达水平，比如高表达和敲低或敲除，从正反两方面揭示其参与疾病的机制。基因修饰技术已逐渐推广到大多数常用实验动物。家兔是常用实验动物之一，与大鼠和小鼠相比，其体型相对较大，便于取材和手术操作。由于家兔的生物学特征，其在心血管疾病、生物反应器、免疫学和病毒学等研究领域被广泛应用［1－4］。转基因家兔在这些领域也被广泛用来研究相关疾病的发病机制，尤其是在心血管疾病研究领域。人胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)是一个极度疏水的糖蛋白，包含476个氨基酸，其中非极性氨基酸占45%，在胆固醇逆向转运中，CETP能够促进胆固醇酯从高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)转运到含载脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)的脂蛋白颗粒中，同时反向转运甘油三酯(triglyceride，TG)，抑制CETP可能能够增加循环中HDL水平的升高。近年来CETP因参与血浆脂蛋白胆固醇水平的调控和脂蛋白颗粒的重塑，在脂蛋白代谢中的作用倍受重视［5］。但是，CETP究竟是抗心血管疾病发生因子还是促进心血管疾病因子一直存在争议［6］。为了研究CETP参与血脂代谢和炎症进而参与动脉粥样硬化的分子，我们设计了人CETP肝脏细胞特异性表达载体，用显微注射方法制作CETP转基因家兔，为研究CETP与心血管疾病，主要是动脉粥样硬化的关系提供动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性、雄性SPF级日本大耳白兔各50只，3月龄，体重2.5 kg左右，来源于西安交通大学医学部实验动物中心【SCXK(陕)2012－003】。动物饲养室的温度、光照、噪声和换气次数等均符合国标要求(GB14925－2010)，自由饮水和采食。该研究通过了西安交通大学实验动物管理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器

卵泡刺激素和绒毛膜促性腺激素(宁波市三生药业有限公司，中国)，透明质酸酶(Sigma，美国)、2× PCR Mix、反转录和 rael－time PCR 试剂(Takara，日本)，质粒、血液或组织全基因组DNA、总RNA和总蛋白质提取试剂盒(Omega，美国)，CETP抗体(Abcam，英国)和活性鉴定试剂盒(BioVision，中国)，Sal I内切酶(Fermentas，立陶宛)，M2 和 M16培养液(自制)。仪器:P－97 拉针仪(Sutter，美国)，MF－900烧针仪(Narishige，日本)，体视显微镜(O－lympus，日本)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，显微注射系统(Eppendorf，德国)，PCR 仪(Eppendorf，德国)，蛋白电泳系统(Bio－Rad，美国)。

1.3 转基因动物制作［7］

人CETP转基因家兔制作采用经典的显微注射方法。动物实验操作在西安交通大学医学部实验动物中心进行【SYXK(陕)2012－005】。

1.3.1 基因载体构建

将人CETP(cDNA，NM_000078)基因克隆连接到pJC13质粒，置于apoE启动子控制之下，以控制其在肝脏特异性表达，扩增、纯化后用于显微注射。

1.3.2 激素注射程序

给供体雌性家兔皮下注射卵泡刺激素诱导同期发情，每隔0.5 IU/12 h，共注射3 d 6次。供体雌兔在实验第4天进行自然交配或人工授精，随后肌肉注射绒毛膜促性腺激素150 IU，刺激卵巢排卵。

1.3.3 准备代孕雌兔

实验第4天，代孕雌兔与供体兔同时注射150 IU hCG，使代孕雌兔子宫、输卵管与显微注射后的受精卵处于生理同期。

1.3.4 收集受精卵和显微注射

实验第5天，过量麻醉处死供体兔，打开腹腔取其输卵管、部分子宫和卵巢。用M2培养液冲洗输卵管，收集得受精卵并冲洗。受精卵转移至M16培养液，至于二氧化碳培养箱备显微注射。将受精卵转移至显微注射平台，调整持卵针和显微注射针。在低倍镜定位受精卵，200倍视野下观察，可明显观察到两个原核的卵为受精卵。移动持卵针向备注射的受精卵，利用负压固定受精卵，注射针刺入雄性原核并进行目的基因溶液的注射，观察到雄原核稍膨胀，拔掉注射针。

1.3.5 胚胎移植

麻醉代孕雌兔，取俯卧位，脊柱旁侧开0.5～1 cm切口，用平镊夹住卵巢上方的脂肪垫，将输卵管拉出腹腔。将显微注射完的受精卵用自制移卵管移植到受体兔输卵管，稍停顿以避免受精卵流失。移植完毕将输卵管送回腹腔。

1.3.6 模型鉴定

将离乳后仔兔剪去少许组织或采150 μL血，提取基因组 DNA，进行 PCR 检测。Sense，5＇－TCAGCCACTTGTCCATCGC－3＇;Anti－sense， 5＇－GGCATCGGTCCGCACTCTA－3＇，产物大小:230 bp。程序:95℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行35 个循环，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(20 g/L)。

1.4 目的基因表达分析

将F0代CETP转基因家兔禁食16 h，抽血，3000 r/min离心分离血浆，检测血浆中CETP的表达和活性和总胆固醇(total cholesterol，TC)。繁殖CETP转基因家兔，处死F1代转基因家兔1只和同窝非转基因家兔1只，按试剂盒说明书提取各主要脏器总蛋白和总RNA备用。Rael－time PCR CETP用引物序列同上，家兔GAPDH引物序列:Sense，5＇－ATCACTGCCACCCAGAAGAC－3＇;Anti－sense，5＇－GTGAGTTTCCCGTTCAGCTC－3＇，PCR 反应反应体系为SYBR®Premix Ex TaqTMII(10 μL)，上下游引物各1 μL(10 mol/L)，cDNA 模板1 μL，加双蒸水7.0 μL。反应条件:95℃ 30 s开始程序，95℃ 5 s，55℃ 40 s共40个循环。CETP Western blot和活性测定，按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 基因构建

pJC13－apoE－hCETP 质粒构建成功 (图 1A)，ApoE启动子用于控制人CETP基因的组织特异性表达。含有目的基因的质粒载体扩增、提取后酶切，线性化目的基因用于显微注射(图1D)。

2.2 目的基因注射与模型鉴定

收集受精卵后，将目的基因溶液注射到雄原核，雄原核稍膨大(图1B，C)，注射后的受精卵进行胚胎移植。代孕家兔产下仔兔，离乳后抽取150 μL血样，提取全基因组DNA进行常规PCR检测，PCR产物琼脂糖电泳结果显示我们获得了人CETP转基因阳性家兔(图1E)。

2.3 转基因效率

注:A.转基因载体设计;B，C.显微注射;D.转基因载体的准备;E.仔兔转基因携带情况检测。M.DNA marker;P.质粒;D 1～3.SalⅠ酶切后的质粒;E.－阴性对照;+阳性对照;E1～5:仔兔基因PCR扩增产物样本。图1 转基因载体的准备Note.A.Design of the transgenic vector preparation;B，C.Microinjection;D.Preparation of transgenic vector;E.Detection of offsprings carrying the transgenes;M.DNA marker;P.Plasmids;Fig.1D 1－3.Plasmid after Sal I enzyme digestion;Fig.1E. － Negative control，+Positive control;Fig.1E1～5.Samples of PCR product amplification of the offspring genes.Fig.1 Preparation of transgene，microinjection and the PCR test results of the offsprings

本次人CETP转基因家兔制作实验中，共收集到1522枚受精卵，有868枚受精卵适合显微注射。显微注射后移植入32只受体兔，其中11只受孕(34.3%)，产仔45只，转基因阳性幼兔1只，转基因效率约为2.2%。

2.4 转基因表达与活性

Western Blot方法被用来检测了人CETP转基因家兔中CETP转基因的表达，由于人CETP转基因和家兔内源性CETP具有交叉反应，故未能确定其表达量。Real－time PCR检测结果发现，在转基因家兔各主要组织器官中，人CETP转基因主要在肝脏表达，与设计的相一致(图2)。血浆中CETP的活性检测结果显示，转基因家兔CETP活性为每小时25.2 pmol/μL，同窝非转基因家兔CETP活性为每小时17.2 pmol/μL，转基因家兔活性高于非转基因家兔。转基因家兔血浆TC为19 mg/dL，同窝非转基因家兔血浆TC为18 mg/dL，但转基因家兔血浆HDL－C为4 mg/dL，显著低于非转基因家兔的12 mg/dL。

注:1.肝;2.心脏;3.脾;4.肺;5.肾;6.肾上腺;7.脂肪;8.肌肉;9.睾丸;10.主动脉弓;11.肺巨噬细胞;12.脑;13.脊髓;14.小肠。图2 人CETP转基因在模型家兔主要器官/组织的mRNA表达水平Note.1.Liver，2.Heart，3.Spleen，4.Lungs，5.Kidneys，6.Adrenal glands，7.Fat，8.Muscle，9.Testes，10.Aortic arch，11.Pulmonary macrophages，12.Brain，13.Spinal cord，14.Small intestine.Fig.2 The mRNA expression levels of human CETP transgene in the main organs/tissues of transgenic rabbits

3 讨论

转基因家兔作为重要的生命医学研究用动物模型，在心血管疾病、感染性疾病以及代谢性疾病等的研究中具有重要的科研价值，随着生物技术的发展，它在生命医学研究的其他领域也越来越受到重视［4，7－9－11］。目前为止，显微注射法仍是制作转基因动物的最常用方法之一。在本研究中，我们利用显微注射方法制作成功人CETP转基因家兔，为相关研究提供了良好的候选动物模型。CETP作为可能的心血管疾病的治疗靶点，最近几年很受研究人员重视，并投入了很多精力进行相关研究。虽然CETP转基因小鼠已经研发成功，但利用该模型取得的研究成果仍存在很多争议［4，7－9］。这与小鼠本身的生物学特性有很大关系，小鼠脂质代谢与人类的差异是其可能原因之一。小鼠体内富含HDL，ApoE敲除后HDL和LDL均升高，其动脉粥样硬化病变与人类存在差异，小鼠缺乏CETP，导致其胆固醇代谢与人类存在差异［10］。因此基于小鼠等啮齿类动物模型的有关CETP的研究可能存在一定先天性缺陷。

目前针对CETP抑制剂的研究陷于相对被动的局面［11］。这其中的一个重要原因可能是先期动物模型的选择存在问题，大多基于啮齿类模型的研究结果尚需进一步确证。在本研究中我们建立了人CETP转基因家兔，该模型在肝脏特异性高表达人CETP，并释放入血。血浆检测CETP活性在转基因家兔明显升高，并最终影响了血浆HDL－c的浓度。这些特征表明该模型在CETP与心血管疾病的研究中具有重要的应用价值。家兔属于兔形目动物，在系统发育上比啮齿类实验动物更接近人类;家兔脂蛋白特征与人类相似，富含LDL，脂蛋白代谢更适合人类心血管疾病研究，另外，与啮齿类动物相比，家兔体型大，更容易进行主要脏器功能检测、血液生化学分析和实验操作［10］。在他汀类药物的发现、药效评价和最终被应用的历史中，他汀类药物在啮齿类动物中的研究结果趋于阴性结论，但在家兔模型的研究中展现出良好的降血脂作用，这为他汀类药物最终得以发掘和应用于临床起到了重要推动作用［12］。本模型的研发成功和应用，必将进一步加深研究者对CETP和动脉粥样硬化相关疾病关系的认识。

［1］Manning PJ，Ringler DH，Newcomer CE.The biology of the laboratory rabbits［M］.San Diego USA:Academic Press Inc，1994:367－380.

［2］Fan J，Watanabe T.Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models ［J］.Pharmacol Ther，2003，99(3):261－282

［3］刘恩岐，范江霖.转基因兔在动脉粥样硬化中的应用及发展［J］.中国动脉硬化杂志，2003，11(4):371－375.

［4］Zhao S，Wei K，Yu Q，et al.General topic:applications of transgenic rabbits in biomedical research－based on literature search［J］.World Rabbit Sci，2010，18(3):159 －167.

［5］Polk D，Shah PK.Cholesterol ester transfer protein(CETP)and atherosclerosis［J］.Drug Discov Today Ther Strateg，2007，4(2):137－145.

［6］Kappelle PJ，Perton F，Hillege HL，et al.High plasma cholesteryl ester transfer but not CETP mass predicts incident cardiovascular disease:a nested case－control study ［J］.Atherosclerosis，2011，217(1):249－252.

［7］刘恩岐，郑华东，赵四海，等.转基因家兔的制作［J］.动物学杂志，2006，41(3):64－71.

［8］赵四海，郑华东，刘恩岐.生物医学研究中实验动物的应用状况与分析［J］.中国比较医学杂志，2006，16(4):245－248.

［9］Zhao S，Liu E，Chu Y，et al.Numbers of publications related to laboratory animals［J］.Scand J Lab Anim Sci，2007，34(2):81－86.

［10］Rader DJ，Degoma EM.Future of cholesteryl ester transfer protein inhibitors［J］.Annu Rev Med，2014，65:385 －403.

［11］Shiomi M， ItoT. TheWatanabeheritablehyperlipidemic(WHHL)rabbit，its characteristics and history of development:a tribute to the late Dr.Yoshio Watanabe［J］.Atherosclerosis，2009.207(1):1－7.