基因芯片检测技术快速诊断耐药肺结核的效果分析

何建 谭芳



·短篇论著·

基因芯片检测技术快速诊断耐药肺结核的效果分析

何建 谭芳

通过耐药检测了解结核分枝杆菌的耐药情况，并以此为依据指导抗结核化疗方案的制定，对于耐药结核病的临床治疗具有重要的意义。传统耐药结核病的诊断是根据痰结核分枝杆菌培养及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)来判断，但检测耗时较长。目前对此类肺结核的早期、快速诊断是研究热点，且有一些新技术出现。我院自2013年7月份采用基因芯片检测技术进行了结核分枝杆菌对INH和RFP是否耐药的快速检测，同时与传统痰结核分枝杆菌培养及药敏试验结果进行对照，以分析该项技术对耐药结核病的诊断效果。

资料和方法

一、 研究对象

搜集2013年7月1日至2014年11月30日宜昌市所有登记为痰涂片阳性和痰结核培养阳性的肺结核患者共296例。各县(区)由经过培训的专业人员将涂阳肺结核患者的痰标本或涂阴患者的痰结核分枝杆菌培养阳性菌株，用痰标本和菌株运输箱运送至宜昌市第三人民医院实验室。宜昌市第三人民医院实验室收到标本或菌株后，于24 h内采用基因芯片技术检测结核分枝杆菌的耐药性。同时对痰涂片阳性标本进行结核分枝杆菌培养及药敏试验，送检的结核分枝杆菌培养阳性菌株经菌种鉴定后进行药敏试验。

二、 标本纳入情况

在此期间共收到来自于296例患者的痰菌阳性标本共296份，其中痰涂片阳性标本233份，培养阳性标本63份。 233份痰涂片阳性标本进行传统结核分枝杆菌培养成功219份，培养阴性14份；培养阳性的63份标本有2份进行菌种鉴定结果为非结核分枝杆菌而未予纳入。因此,共有痰涂片阳性标本219份及培养阳性标本61份共280份痰菌阳性标本入选。

三、检测方法

(一)痰涂片找抗酸杆菌

采用萋尔-尼尔逊染色法，严格按操作步骤进行，由经过培训并考核合格的专职人员完成。

(二)痰结核分枝杆菌培养及药敏试验

对痰标本采用酸性改良罗氏培养基进行结核分枝杆菌分离培养。对培养阳性菌株采用对硝基苯甲酸(PNB)进行结核分枝杆菌复合群初步鉴定，PNB培养基上不生长即为结核分枝杆菌复合群；PNB培养基上生长即为非结核分枝杆菌。 对结核分枝杆菌采用绝对浓度法进行药敏试验。试验方法严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》[1]。低浓度含药培养基未生长分枝杆菌报告敏感，生长者报告耐药。

(三)基因芯片耐多药检测技术

采用北京博奥生物有限公司生产的基因芯片检测系统。试剂盒采用晶芯结核分枝杆菌耐药检测试剂盒[中国卫生部-比尔和梅琳达·盖茨基金会结核病防治合作项目(简称“中盖结核病项目”) 免费提供]。

1.检测标本：对痰涂片阳性标本或培养阳性标本进行基因芯片检测。

2.检测方法：采用N-乙酰左旋半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)方法对痰涂片标本进行前处理，基因芯片的检测按照中盖结核病项目提供的《基因芯片检测标准操作程序》进行。基因芯片检测操作过程中的DNA置-20 ℃保存，用于无结果时重复操作及后续的DNA复核。芯片耐药性检测结果可判定为结核分枝杆菌对INH和RFP敏感、单耐INH、单耐RFP、耐多药。

3. 判定方法：若耐药非高危人群第1次基因芯片检测结果为RFP耐药时，需采用该患者的另1份涂阳或培养阳性标本进行第2次基因芯片检测。2次基因芯片检测结果均显示为RFP耐药时，判定患者为RFP耐药。当2次基因芯片检测结果不一致时，判定该患者为RFP敏感。

四、 统计学处理

以SPSS 15.0软件对数据进行统计学分析。各组间率的比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两种方法不同耐药类型的检测结果

根据绝对浓度法药敏试验结果推断单耐RFP率为 5.00%(14/280)，单耐INH率为5.71%(16/280)，耐多药率为3.57%(10/280)。对280份标本同时采用基因芯片检测技术(简称“基因芯片”)和传统药敏试验，并对结果进行对照分析。基因芯片与传统药敏试验比较检测RFP耐药率差异无统计学意义(χ2=0.16，P>0.05)；对INH耐药率检测差异无统计学意义(χ2=0.33，P>0.05)；耐多药耐药率差异无统计学意义(χ2=0.05，P>0.05)(表1)。

280份标本采用两种方法检测对RFP耐药的一致性情况进行分析，有4份传统药敏试验检测对RFP敏感但基因芯片未检测出结果；有2份传统药敏试验检测对RFP耐药而基因芯片检测为敏感；有1份传统药敏试验检测对RFP敏感而基因芯片诊断为耐多药。在检测的280例患者中有273例患者的传统药敏试验结果与基因芯片结果一致，一致率为97.50%。

表1 两种耐药检测方法对FRF和INH耐药的检测结果

280份标本采用两种方法检测对INH耐药的一致性情况进行分析，有5份传统药敏试验检测对INH敏感但基因芯片未检测出；有3份传统药敏试验检测对INH耐药而基因芯片检测为敏感；有1份传统药敏试验检测对INH敏感而基因芯片检测为耐多药。在检测的280例患者中有271例患者的传统药敏试验结果与基因芯片结果一致，一致率为96.78%。

在传统药敏试验诊断单耐RFP的14份标本中，基因芯片诊断出12份；在传统药敏试验诊断为RFP敏感的266份中，基因芯片诊断出261份，因此基因芯片诊断单耐RFP的敏感度为85.71%(12/14)，特异度为98.12%(261/266)。

在传统药敏试验诊断单耐INH的16份标本中，基因芯片诊断出13份；在传统药敏试验诊断为INH敏感的264份中，基因芯片诊断出258份，因此基因芯片诊断单耐INH的敏感度为81.25%(13/16)，特异度为97.73%(258/264)。

在传统药敏试验诊断耐多药的10份标本中，基因芯片诊断出10份；在传统药敏试验诊断为非耐多药的270份标本中，基因芯片诊断出269份，因此基因芯片诊断耐多药的敏感度为100.00% (10/10)，特异度为99.63%(269/270)。

二、 痰涂片及分离株两种标本行基因芯片的检测结果

痰涂片标本行基因芯片检测结果显示，单耐RFP率为 4.11%(9/219)，单耐INH率为4.57%(10/219)，耐多药率为3.65%(8/219)。 分离株标本行基因芯片检测结果显示，单耐RFP率为 4.92%(3/61)，单耐INH 率为4.92%(3/61)，耐多药率为4.92%(3/61)。痰涂片标本及分离菌株标本行基因芯片检测单耐RFP率差异无统计学意义(χ2=0.08，P>0.05)，两种标本行基因芯片检测单耐INH率差异无统计学意义(χ2=0.01，P>0.05)，耐多药率差异无统计学意义(χ2=0.20，P>0.05)(表2)。

讨 论

传统诊断耐药结核病的方法是采用酸性改良罗氏培养基进行分枝杆菌分离培养并通过药敏试验测定证实[2-3]。该方法简单、经济，但从培养到得出药敏试验结果常常需要2～3个月甚至更长的时间，难以满足耐药结核病的早期诊断，一定程度上延误了对耐药结核病患者的治疗。

世界卫生组织[4]在《耐药结核病规划管理(PMDT)指南(2011年更新版)》提出：耐药结核病的早期发现是在制订耐药结核病检查和治疗策略时需要考虑的关键因素之一。 因此，推荐开展对INH和RFP或RFP的快速药敏试验，以替代传统试验或在诊断结核病时不进行药敏试验的模式。而在2 d内达到早期诊断，完成对INH和RFP的耐药性检测，只有分子生物学检测技术才能达到此目的。

宜昌市是中盖结核病项目二期全国3个试点地区之一(于2013年7月正式启动)，该项目最大的特点是“三新一加强”。“三新”是指新的实验室诊断技术、新的患者管理技术和新的经费筹资模式；“一加强”是指加强结核病防治服务体系。其中新的实验室诊断技术是“基因芯片法快速耐药结核病检测技术”。 该方法利用结核分枝杆菌耐药检测试剂盒和相关仪器通过核酸提取、PCR扩增、芯片杂交与清洗、芯片扫描等过程,分别对结核分枝杆菌对INH和RFP耐药的相关基因KatG、inhA和rpoB常见突变位点进行检测，从而判断是否耐药，可以在6 h内得到结果[5]。

本研究结果显示，基因芯片检测技术与传统药敏试验比较检测RFP耐药与否的结果一致率为 97.50%，检测INH的结果一致率均为96.78%。诊断单耐INH的敏感度为81.25%，特异度为97.73%。诊断单耐RFP的敏感度为85.71%，特异度为98.12%。诊断耐多药的敏感度为100.00%，特异度为99.63%。与赵冰等[6]采用基因芯片法结核分枝杆菌耐药检测技术检测对INH、RFP是否耐药的结果接近。从表2结果显示，痰涂片标本及分离菌株标本行基因芯片法技术检测单耐RFP率、单耐INH率、耐多药率差异无统计学意义，提示基因芯片耐药检测技术对痰涂片标本及分离菌株标本均有相似的检测效果。

表2 两种不同来源标本进行基因芯片检测结果

在《耐药结核病规划管理指南(2011年更新版)》中，世界卫生组织推荐的两种分子生物学技术为线性探针和Xpert Mtb/RIF技术[4]。其中线性探针技术同样是通过检测结核分枝杆菌耐药相关基因来实现快速检测的目的。据国内黄玉平等[7]报道，采用线性探针技术检测与传统药敏试验比较，二者检测的耐RFP一致率达98%，耐INH结果一致率为97%；诊断耐RFP的敏感度为82.8%，特异度为99.3%；诊断耐INH的敏感度为80.4%，特异度为99.3%。笔者采用与线性探针技术相似的基因芯片法检测技术所得的检测结果与文献[7]的报告大致相似。以上均提示，在现有条件下采用基因芯片技术对RFP和INH耐药性进行检测，具有较高的敏感度和特异度。

按照本研究所得的传统药敏试验结果，宜昌地区单耐RFP率为 5.00%，单耐INH率为5.71%，耐多药率为3.57%，与2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查的报告结果相比较，单耐INH率、耐多药率低于全国水平[8]，提示本地区结核病规划治疗管理取得了一定的效果。由于本研究的患者例数较少，也可能不足以反映当地的结核病疫情情况。

值得一提的是，在我院诊断为耐多药的1例患者属于非耐药高危者，行2次基因芯片检测均提示为同时对INH和RFP耐药；但传统药敏试验提示为对INH和RFP均敏感。两种方法有明显差别的可能原因如下：(1)作为一种快速检测方法，基因芯片法检测结果本身就未能达到100%的准确率。(2)晶芯结核分枝杆菌耐药检测试剂盒由于对位点检测及后续杂交的特异性问题，也存在将野生型误判为突变型的可能，有学者曾有相关报道[9]。(3)传统药敏试验结果受到多种因素影响，结核分枝杆菌菌悬液含菌量对结核分枝杆菌药敏试验有一定影响。含菌量越少，检测结果的敏感率越高；而含菌量越高，检测结果的耐药率也高[10]。对于此种情况，笔者认为尽管传统药敏试验结果为判断耐药性的金标准，但仍应再次行传统药敏试验检测，尽量考虑和避免传统药敏试验可能出现误差的各个环节，不能轻易否定基因芯片技术的检测结果；有条件时更应该对患者进行耐药相关基因的测序，以进一步判断检测结果的准确性，并复检该菌株表型的耐药性。如果基因芯片检测结果与传统药敏试验结果有差异，应采用基因芯片技术反复检测3次，以进一步验证检测结果的可靠性。

笔者所在的宜昌市也为第五轮中国全球基金耐多药结核病防治项目湖北省二期所在地区，该项目采用的耐药结核病诊断方法为传统药敏试验，从培养到得出药敏试验结果常常需要2～3个月甚至更长的时间。相比较而言，中盖结核病项目开展的基因芯片检测技术的最大优点是检测所需时间短，而且对于RFP和INH耐药性诊断方面具有较高的敏感度和特异度，因此可为耐药结核病的诊断提供有力依据。这对实现耐药结核病的早期诊断、早期治疗具有重要参考价值。

[1] 中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程.中国防痨杂志，1996,18(1)：28-31.

[2] 中国防痨协会.耐药结核病化学治疗指南(2015). 中国防痨杂志,2015，37(5)：421-469.

[3] 中华医学会.临床技术操作规范·结核病分册. 北京：人民军医出版社，2004：29-46.

[4] 世界卫生组织.耐药结核病规划管理指南(2011年更新版).日内瓦：世界卫生组织，2011：13-15.

[5] Guo Y，Zhou Y，Wang C，et al.Rapid, accurate determination of multidrug resistance inM.tuberculosisisolates and sputum using a biochip system. Int J Tuberc Lung Dis， 2009,13(7):914-920.

[6] 赵冰,金艳,逄宇，等. 基因芯片结核分枝杆菌耐多药检测在地市级实验室的应用性评估.中国防痨杂志,2013，35(9)：718-722．

[7] 黄玉平,屈亚虹,马振亚,等. 应用线性探针技术快速诊断耐多药肺结核效果分析.中国防痨杂志,2011，33(11)：722-724．

[8] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志,2012，34(8)：485-508．

[9] 施美华,唐佩军,叶志,等.基因芯片法对苏州市结核临床分离株INH耐药性快速检测的价值.结核病与肺部健康杂志,2013，2(3)：164-168．

[10] 黎友伦,陈保文,沈小兵,等.结核分枝杆菌接种菌量对异烟肼和利福平药敏试验的影响.中国防痨杂志,2006，28(5)：288-291．

(本文编辑：范永德)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.019

443003 湖北省宜昌市第三人民医院结核科

何建，Email: hejian0914@sina.com

2015-06-11)