两种分子检测技术快速诊断骨关节结核及其耐药性的研究

梁瑞霞 谷蕴婷 董伟杰 姜广路 李云絮 马异峰 尚媛媛 秦世炳 黄海荣 王桂荣



·论著·

两种分子检测技术快速诊断骨关节结核及其耐药性的研究

梁瑞霞 谷蕴婷 董伟杰 姜广路 李云絮 马异峰 尚媛媛 秦世炳 黄海荣 王桂荣

目的 评价两种分子检测技术——利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF，简称“Xpert”)和GenoType®MTBDRplus线性探针检测技术(简称“MTBDR”)快速诊断骨关节结核及其耐药性的临床应用价值。方法 2014年3—6月连续收集北京胸科医院住院的60例疑似骨关节结核患者的脓标本，每份标本行涂片抗酸杆菌检查、MGIT960分枝杆菌培养、Xpert和MTBDR检测，培养阳性的结核分枝杆菌行绝对浓度法药物敏感性试验(DST)检测。以临床诊断参考标准(CRS)为金标准, 评价Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度。以DST为金标准，评价Xpert和MTBDR检测脓中结核分枝杆菌耐药性的敏感度和特异度。结果 以CRS为金标准，涂片、培养、Xpert和MTBDR的敏感度分别为26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，10例非结核病患者脓标本4种技术检测结果均为阴性。以DST为金标准，6例 RFP耐药样本中，Xpert检测RFP耐药全部阳性，MTBDR检测RFP耐药5例阳性；18例RFP敏感样本中2种技术检测结果均为阴性。7例INH耐药样本中，MTBDR检测INH耐药6例阳性；17例INH敏感样本中MTBDR技术检测结果均为阴性。结论 Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度高，并且可同时检测其耐药性，可用于早期诊断骨关节结核及其耐药性。

结核, 骨关节/诊断； 抗药性, 细菌； 实时聚合酶链反应； 核酸杂交

结核病严重危害人类健康，是伴随人类历史最长的疾病之一，也是全球由单一致病菌导致死亡人数最多的疾病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者数仅次于印度居世界第二位[1]，我国也是全球27个耐多药结核病(multiple drug resistant tuberculosis, MDR-TB) 高负担国家之一。骨关节结核在所有结核病中占3%～5%，在肺外结核中占15%[2]。患者若长期得不到有效治疗，会大大增加后遗症风险，如脊柱弯曲、棘突隆起、背部驼峰畸形、截瘫等，这些后遗症将给患者造成终生身体和精神痛苦。因此，在MDR-TB高负担国家中，快速诊断骨关节结核及其耐药性，对骨关节结核病的早期诊断和早期治疗，以及对结核病疫情的控制均具有重要意义。

细菌学检查为结核病诊断的“金标准”，然而骨关节结核的标本分枝杆菌培养阳性率低、时间长，不能满足临床早期、快速诊治的需要，所以迫切需要能够快速检测结核分枝杆菌复合群和耐药的新方法和新工具。

近年来涌现出了许多新型分子诊断技术，利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF，简称“Xpert”)和GenoType®MTBDRplus线性探针检测技术(简称“MTBDR”)是其中使用比较广泛的技术。Xpert以全自动半巢式实时PCR技术为基础，以rpoB基因为靶基因，可在2 h内同时检测Mtb及其是否对RFP耐药[3]。2010年WHO推荐Xpert用于肺结核的诊断[4]。2013年WHO又推荐Xpert用于肺外结核的诊断[5]。MTBDR运用核酸线性探针杂交技术，检测异烟肼与利福平耐药的相关基因，可在24 h内完成耐多药结核分枝杆菌检测[6]。2008年WHO推荐MTBDR应用于涂阳肺结核患者的结核分枝杆菌及其耐药检测[7]。

一些Meta分析显示，分子诊断技术在肺外结核病的诊断中具有较高的敏感度和特异度[8-10]。目前，国内外还没有对Xpert和MTBDR在骨关节结核早期诊断中的价值进行评价。笔者以临床诊断参考标准(CRS)和绝对浓度法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)为金标准, 评价Xpert和MTBDR快速诊断骨关节结核及其耐药性的临床应用价值。

材料和方法

一、 研究对象及其临床一般情况介绍

选取2014年3—6月北京胸科医院收治的疑似骨关节结核患者60例。根据CRS标准[11]，60例患者分为4组：确诊骨关节结核患者(结核分枝杆菌培养阳性)24例；临床诊断骨关节结核患者(结核分枝杆菌培养阴性、活检或手术标本病理检查显示为干酪样肉芽肿，并且对抗结核药物治疗反应良好)22例；疑似骨关节结核患者(没有细菌学及病理学证据，但是对抗结核药物治疗反应良好，影像学征象符合骨关节结核)4例；非结核病患者(没有细菌学等其他结核检测方面的证据，并且抗结核药物治疗无效)10例。60例患者的中位年龄为33岁(16～82岁)；男28例(占46.67%)，女32例(占53.33%)；脊柱病变累及1个椎体者4例(占6.67%)、累及2个椎体者27例(占45.00%)，累及3个椎体者2例(占3.33%)，累及4个椎体者3例(占5.00%)，患者详细信息见表1。所有患者均接受病灶清除手术，术中所取病灶中的脓液标本至少5 ml。

二、 涂片查抗酸杆菌

脓液涂片抗酸杆菌检查按照文献[12]中的标准化操作程序执行。

三、 分枝杆菌培养

取2 ml 脓标本用于培养，严格按照Bactec MGIT960系统操作说明书进行，培养时间设定为42 d。仪器报告阳性后，取培养液进行涂片镜检，若查到抗酸杆菌则为阳性；若未见抗酸杆菌则为阴性。

四、 Xpert检测

取1 ml 脓标本置于有螺旋盖的无菌管中，然后加入2 ml 标本处理液，旋紧管盖，在涡旋振荡器上涡旋振荡10 s，室温静置10 min，在涡旋振荡器上再次涡旋振荡10 s，室温静置5 min，使脓标本充分液化。吸取2 ml 液化的脓标本至Xpert反应试剂盒，然后将反应试剂盒放置到检测模块，仪器开始进行自动化检测。反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

表1 60列研究对象的一般情况

五、 MTBDR检测

取1 ml 脓标本提取DNA，PCR扩增和杂交严格按照MTBDR试剂盒说明书进行。

六、 绝对浓度法药敏试验

按照中国防痨协会基础专业委员会制定的《结核病诊断实验室检验规程》[13]相关要求进行。

七、统计学分析

以CRS为金标准, 计算Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度。以DST为金标准，计算Xpert和MTBDR检测脓中结核分枝杆菌耐药性的敏感度和特异度。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%。

结 果

一、 Xpert和MTBDR的敏感度和特异度

以CRS为金标准，涂片、培养、Xpert和MTBDR的敏感度分别为26.00% (13/50)、48.00% (24/50)、82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特异度都是100.00% (10/10)(表2)。Xpert和MTBDR对确诊骨关节结核患者检测的敏感度分别为100.00% (24/24)和87.50% (21/24)，对临床诊断骨关节结核患者检测的敏感度分别为72.73% (16/22)和63.64% (14/22)；对4例疑似骨关节结核患者Xpert和MTBDR均检测出1例(表3)。

表2 以CRS为金标准，脓液标本不同检测方法诊断骨关节结核的敏感度和特异度

注 表中括号内数值分别为：敏感度分子为“真阳性例数”，分母为“真阳性例数+假阴性例数”；特异度分子为“真阴性例数”，分母为“真阴性例数+假阳性例数”

二、 药敏试验结果

绝对浓度法药敏试验结果显示，6株结核分枝杆菌对RFP耐药，7株结核分枝杆菌对INH耐药；其中6株为耐多药结核分枝杆菌，1株为INH单耐菌株。以DST为金标准，6例RFP耐药样本中，Xpert检测全部阳性，MTBDR检测5例阳性；18例RFP敏感样本中2种技术检测结果均为阴性。7例INH耐药样本中，MTBDR检测6例阳性；17例INH敏感样本中MTBDR检测结果均为阴性。

表3 Xpert和MTBDR诊断不同CRS类型骨关节结核的敏感度

注 表中括号内数值分子为“真阳性例数”，分母为“真阳性例数+假阴性例数”

讨 论

本研究中以CRS为金标准，Xpert和MTBDR检测脓标本结核分枝杆菌的敏感度分别为82.00% (41/50)和72.00% (36/50)，特异度均为100%。Vadwai等[14]的研究结果显示，以CRS为金标准Xpert诊断肺外结核总的敏感度为80.57%(228/283)，特异度为99.60%，与本研究结果一致。

以CRS为金标准，在涂片阴性的标本中Xpert和MTBDR的阳性率分别为75.68% (28/37)和62.16% (23/37)；在培养阴性的标本中Xpert和MTBDR的阳性率分别为65.38% (17/26)和57.69% (15/26)。与分子诊断技术相比较，结核分枝杆菌培养的阳性率(48.00%)较低，原因可能为：(1)本研究纳入的骨关节结核患者在采样前都开展了一段时间的抗结核药物治疗，而抗结核药物治疗会影响结核分枝杆菌的培养阳性率，但对分子诊断技术影响较小。(2)脓标本较黏稠，结核分枝杆菌分布不均匀，可导致取样差异。 (3)培养过程中的标本去污染步骤可能会损失一些活细菌。

分子诊断技术最显著的特点是用时短，如Xpert可在2 h内完成同时检测Mtb和RFP耐药，MTBDR可在24 h内完成耐多药结核分枝杆菌检测，与传统培养比较时间缩短了几周。骨关节结核由于缺乏细菌学诊断依据，以往主要根据影像学、病理学和临床症状进行临床诊断。骨关节结核的早期诊断及其药物敏感度的获得可以指导临床对患者进行早期、合理的治疗[2]。

本研究中Xpert较MTBDR的敏感度稍高，可能是由于Xpert的操作步骤绝大部分都是自动化的，而MTBDR需要很多手动操作步骤，如提取DNA和杂交等，可能会造成敏感度降低[15]。Xpert仅检测RFP的耐药情况，在RFP单耐药高发的地区，如中国RFP单耐药率高达12.83%[16]，可能会高估MDR-TB。在这种情况下MTBDR则比较有优势，因为MTBDR同时检测RFP和INH的耐药情况。但MTBDR的缺点为需要大量的手工操作，结果的判读对技术人员要求较高，而且需要生物安全级别较高的实验室[17]。

Xpert和MTBDR检测脓标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度均较高，而且检测时间短，可同时检测结核分枝杆菌及其耐药。但目前国家食品药品监督管理总局仅批准这两项技术用于涂阳标本的检测，由于骨关节结核病灶中菌量较少，脓液抗酸染色涂片阳性率仅为10%～30%[18-19]，若Xpert和MTBDR仅用于涂阳标本的检测，则临床意义并不显著；若能应用于临床诊断骨关节结核标本的检测，则能够促进骨关节结核的早期诊断和早期治疗，不仅可控制病情进展、缩短治疗疗程，还可以减轻患者经济压力、减少或避免肢体功能障碍。

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(本文编辑：范永德)

Study on two molecular techniques for rapid diagnosis of bone and joint tuberculous and detection of rifampin and/or isoniazid resistance

LIANG Rui-xia*, GU Yun-ting, DONG Wei-jie, LI Yun-xu, MA Yi-feng, SHANG Yuan-yuan, QIN Shi-bing, HUANG Hai-rong, WANG Gui-rong.

*Department of Tuberculosis, Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450008, China

WANG Gui-rong, Email:276761010@qq.com

Objective To determine the performance of a real-time polymerase-chain reaction (PCR) assay Xpert Mtb/RIF (Xpert) and a molecular line probe assay GenoType®MTBDRplus (MTBDR) for rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis (BJTB) and detection of rifampin (RIF) and/or isoniazid (INH) resistance. Methods Sixty pus specimens were obtained from suspected BJTB between March and June 2014 from the Beijing Chest Hospital. Smear, culture, Xpert and MTBDR were performed for each specimen, and MGIT960 based drug susceptibility testing (DST) was conducted for all the recovered isolates. The sensitivity and specificity of Xpert and MTBDR in detectingMycobacteriumtuberculosiswere assessed in comparison to composite reference standard (CRS). The sensitivity and specificity of these two techniques for detection of RFP and/or INH resistance were assessed in comparison to DST. Results By CRS as a gold standard，the sensitivities of smear, culture, Xpert, and MTBDR were 26.00% (13/50), 48.00% (24/50), 82.00% (41/50), and 72.00% (36/50) respectively. All of the results were negative of these 4 techniques in 10 non-tuberculosis patients. By DST as a gold standard， 6 RFP-resistant isolates and 7 INH-resistant isolates were identified. Xpert was 100% concordant with MGIT DST with regard to the detection of RFP resistance. While MTBDR detected 5 RFP-resistant isolates and 6 INH-resistant isolates, and gave negative results for all the RFP-susceptible and INH- susceptible isolates. Conclusion With high sensitivity and specificity, and the ability to detect drug resistance simultaneously, both Xpert and MTBDR are feasible as diagnostic tools for BJTB in clinical practice.

Tuberculosis, osteoarticular/diagnosis； Drug resistance, bacterial； Real-time polymerase chain reaction； Nucleic acid hybridization

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.11.009

北京市自然科学基金(7132049)；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目(2014-3-084)；重大传染病防治协同创新中心(PXM2015-014226-000058)

450008 郑州，河南省胸科医院结核内科(梁瑞霞)；首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室 北京市耐药结核病研究重点实验室(谷蕴婷、姜广路、李云絮、马异峰、尚媛媛、黄海荣、王桂荣)；首都医科大学附属北京胸科医院骨科 北京骨关节结核诊疗中心(董伟杰、秦世炳)

王桂荣，Email:276761010@qq.com

2015-06-24)