模拟大深度快速上浮脱险兔血浆血管性血友病因子和一氧化氮水平变化

许 骥 何 佳 陈锐勇 顾靖华 刘晓波 陈 新 向 导

快速上浮脱险是一种先进的潜艇单人脱险技术，基于不减压潜水的原理，艇员经过脱险舱快速加压至与艇外压力平衡后，迅速上浮出水面等待援救［1］。理论上，脱险深度越大，机体高压暴露时间越长，减压上浮时循环系统内生成的小气泡越多，越易造成血液循环障碍，发生减压病的风险越高。减压病是现今快速上浮脱险研究迈向大深度所面临的难题之一。目前，针对大深度快速上浮脱险减压病的研究很少，也未见报道能客观反映其损伤和用于临床诊治的敏感指标。本研究采用新西兰兔模拟大深度快速上浮脱险过程，观察实验动物减压病的发生情况，检测实验前和出舱后动物血浆中血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）浓度变化，分析大深度快速上浮脱险对微血管内皮细胞的损伤效应，探寻能反映快速上浮脱险减压损伤的检测指标，为深入研究减压病的发生机制及临床诊治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级成年雄性新西兰兔16只，体重2.9±0.3kg，购自复旦大学实验动物中心，许可证号［SCXK（沪）2014－0004］，在本所动物中心适应性饲养一周后进行实验，饲养期间动物自由饮食。

1.2 主要器材和试剂

模拟快速上浮脱险动物实验舱（烟台宏远公司），3K30型低温高速离心机（德国Sigma公司），680型全自动酶标仪（美国Bio－Rad公司）等。

vWF检测试剂盒（酶联免疫吸附法，批号CEA833Rb）购自武汉优尔生公司，NO检测试剂盒（硝酸还原酶法，批号A012）购自南京建成公司。

1.3 模拟大深度快速上浮脱险方法

将实验兔编号标记后置于模拟快速上浮脱险动物实验舱内，紧闭舱门后由舱控电脑按预设自动加减压程序，在16s内使用压缩空气以指数倍增方式（每4s舱压增加一倍，即舱压以2t／4指数速率增加）快速加压至150m水深压力（1.5MPa，表压），稳压停留80s后，以30KPa／s的速率减压至常压后出舱。

1.4 观察指标和方法

1.4.1 动物行为及减压病：实验前及出舱后观察动物体毛、活动度和反应性，参照实验兔减压病诊断标准［2］判断动物出舱后症状，并计算减压病发生率。

1.4.2 血浆vWF和NO浓度检测：动物于实验前和实验后出舱时从耳缘静脉各采血2ml置于肝素抗凝管中，4℃，5 000r／min，离心10min分离血浆，分别采用酶联免疫吸附法及硝酸还原法检测实验前和出舱后血浆vWF、NO浓度。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件。计量数据以均数±标准差（±s）表示，实验前与出舱后数据比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 动物行为观察及减压病发生率

实验前新西兰兔活跃自如，体毛顺滑，对外界刺激反应灵敏。实验后出舱时动物均存活，其中5只体毛略显凌乱，但反应灵敏，行为正常，无明显减压病症状。另11只出现不同程度的减压病症状，5只病情较轻：体毛凌乱、神态萎靡、行动缓慢、对刺激反应迟钝；6只病情较重：除上述症状外，还有后肢瘫痪、急促喘息等表现，10min内死亡1只。10只存活减压病兔症状均在出舱后1－3h内陆续自行消失，行为逐渐恢复正常。

2.2 血浆vWF和NO浓度变化

出舱后实验兔血浆vWF、NO浓度较实验前均有显著性升高，差异有统计学意义（t值分别为－11.16和－4.93，P＜0.01）。见表1。

表1 实验前后兔血浆vWF和NO浓度（±s，n＝15）

表1 实验前后兔血浆vWF和NO浓度（±s，n＝15）

注：与实验前比较，1）P＜0.01

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3 讨 论

以往研究认为，在不安全减压时，机体组织中溶解的惰性气体会以小气泡的形式析出，从而发生气泡栓塞、机械性压迫组织并引起机体一系列减压病病理反应［3］。与常规减压病有所不同，由于快速上浮脱险过程高压暴露时间较短（一般不超过几分钟），体内惰性气体饱和－脱饱和过程基本都发生在以血液为代表的快组织（依据惰性气体在机体各组织中溶解达到半饱和所需时间不同可将全身组织分为各类理论组织，半饱和时间短的为快组织，时间长的为慢组织）中，极少涉及慢组织［4］，故减压气泡绝大多数出现于血液中。循环系统内的减压气泡对毛细血管和微静脉影响最大，较大的气泡会栓塞微血管，或引起微血管形态改变，血小板黏附，血栓形成，血流瘀滞，微循环障碍，进而影响惰性气体脱饱和，甚至产生大量致病因子，加重减压病症状［5－7］。表明血液中减压气泡对血管内皮的应力刺激引发的某些血管内皮因子改变是伴随着减压损伤出现的，并可能影响减压病病程发展。因此针对某些血管内皮因子的研究可以作为快速上浮脱险减压损伤研究的切入点。

vWF是一种由二硫键结合，在正常凝血过程中发挥重要功能的多聚糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成，存在 Weibel－Palade小体内。当内皮细胞损伤或受到某些物质刺激时，vWF可以在短时间内被释放入血液中，桥连血小板黏附于血管内皮下结构，并与纤维连接蛋白一起与血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb－Ⅲa结合，诱导血小板聚集和血栓形成；同时，vWF能稳定凝血因子Ⅷ促进其活化，加速凝血［8，9］，成为反映血管内皮损伤和血液高凝状态的重要标志物之一。在本研究中，动物减压出舱后血浆中vWF浓度较实验前显著升高（P＜0.01），推测原因可能与减压气泡挤压微血管内壁造成内皮损伤而引发vWF大量释放有关，而且释放量与动物所受减压损伤也可能相关。如果循环系统内出现高水平vWF则可能形成血栓，与气体栓塞一起阻碍微循环，引发脏器缺血，导致减压病，或加重病情。

NO是一种细胞内和细胞间信使分子，可在内皮细胞中合成，具有广泛的生物学作用。本研究结果显示，动物减压出舱后血浆中NO浓度明显高于实验前（P＜0.01）。高浓度NO可导致血管扩张，同时妨碍血小板黏附和聚集［10］。结合快速减压损伤实验后动物血管内血小板黏附、聚集、血栓化，微血管先出现反应性收缩，然后扩张松弛的现象［11］，推测实验后动物血液中NO浓度增高很可能是机体出现减压损伤后的一种应激性保护机制。但微血管后期的扩张松弛会导致血管壁通透性增加，渗出增多，血容量减少，血液流速降低，使得血液中过饱和气泡不易经肺部排出，而更容易通过扩张后的毛细血管盲端进入原本减压气泡很少的深层组织，从而加重减压病病情。另外，过量的NO与氧自由基迅速反应，生成具有巨大细胞毒性作用的亚硝酸自由基，会对机体造成更严重的继发性损伤［12］。

综上所述，大深度快速上浮脱险减压可引起实验动物血浆中vWF和NO水平升高，表明其内皮细胞受到损伤，可能是减压病的发病机制之一。相比目前使用行为学观察或监听血流气泡音判别减压病的方法，血浆vWF和NO浓度测定可提供客观量化的观测指标，但其更多作用和功效还需继续观察和论证，以期应用于快速上浮脱险减压病的风险评判、早期诊断和预防治疗。