海南卷萼兜兰菌根真菌形态学特征与鉴定*

杨 珺，任军方，姜殿强，王丹萍，云 勇

(海南省农业科学院热带园艺研究所，海口571100)

兜兰属为多年生草本植物，是兰科濒危类群之一，海南卷萼兜兰是海南特有的一种兰花，其株型优美、花朵艳丽、花期较长、具有极高的观赏价值。目前，卷萼兜兰的利用整体上仍处于直接从自然界获取的低级阶段，近年来，过度的采挖和环境的恶化使野生资源受到了严重破坏。卷萼兜兰主要繁殖方式是分株繁殖，周期长、且易伤母株，造成卷萼兜兰组培困难，无菌苗移栽成活率很低的原因是兰根中没有形成菌根结构，不能为兰花的生长提供所需的营养物质。组培苗菌根化是解决濒危兰花资源人工栽培的关键，因此，研究兰花与其真菌的结构，探讨菌根真菌与兰科植物之间的相互作用，可以更好地保护、开发和利用海南卷萼兜兰种质资源。该研究对海南卷萼兜兰的菌根菌类进行了初步研究，为卷萼兜兰菌根的深入研究提供参考。

1 卷萼兜兰菌根真菌的分离

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

供试植物：野生卷萼兜兰植株采集于霸王岭国家级自然保护区。

培养基及配方：马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （PDA）：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、水 1 000ml、氯霉素50mg。

1.1.2 方法

分离方法主要参照郭顺星等的关于菌根真菌的分离方法，并略做改进。取卷萼兜兰植株新鲜营养根，清水洗净，75%酒精消毒30s，NaClO溶液 （2%）消毒分别处理1～12min，无菌水冲洗干净后置于PDA培养基上，以接种最后一次冲洗的无菌水作为空白对照，于25℃恒温培养，根段长出菌丝后，挑取边缘菌丝转移至另一平板进行纯化培养，筛选获得纯菌株后,做好编号记录，转移至斜面培养基上保存备用。

1.2 结果与分析

在不同的 NaClO处理中,以 2%NaClO处理 4～6 min为宜，分离结果较为理想，配合以酒精处理时间维持30 s时,分离效果更为明显。经过多次分离纯化后，共得到11种不同分类的真菌菌株，编号为J～01—J～11。

2 菌根真菌的鉴定

2.1 方法

2.1.1 菌落培养特征及形态学观察

将筛选出的卷萼兜兰菌株分别接种至PDA培养基，25℃恒温培养，观察各菌种的生长情况并记录菌落特征，包括菌落形状、大小、正反面颜色、质地以及是否产生色素等情况，挑取长势良好的菌丝经染色后置于光学显微镜下观察菌丝特征及产孢情况。

2.1.2 真菌生长速率的测定

用直径0.5cm打孔器在菌丝生长旺盛的菌落边缘打取菌片，接种于新配好的PDA培养基平板中心，每个菌株3次重复，25℃恒温培养，隔1天观察1次，测量并记录菌落在垂直方向上的直径，记录各个菌落长满整个培养皿的时间，制作菌株的生长速度曲线，其横坐标和纵坐标分别为培养时间和菌落直径，以菌落直径 （cm）除以时间 （天）为真菌菌丝生长速率。

图1 部分真菌菌株的显微结构

2.1.3 菌种鉴定

该试验采用形态学方法对菌根真菌进行初步鉴定，即依据菌株菌落的培养特征、菌株显微形态观察及其生长速率的结果，并结合文献资料综合分析相关特征的异同，最后确定菌株的鉴定分类。

2.2 结果与分析

2.2.1 菌株培养特征及显微结构描述

（1）J～01生长速度快，菌落浅白色，长绒毛菌丝，质地疏松，气生菌丝分叉，边缘整齐，生长1周后整个菌落墨绿色，菌丝有隔，多次分枝。

（2）J～02正面中间灰绿色，边缘白色，菌丝短而紧密，表面不平坦，边缘整齐，背面可见培养基开裂，菌丝有隔，重复多次分枝，排列不规则网状结构。

（3）J～03菌落呈咖啡色与黄色相间，整个菌落突起，中心菌丝似雪花状，气生蓬松，反面墨绿色，边缘白色，菌丝直角分枝，有隔。

（4）J～04菌落白色，扁平，菌丝短，呈棉状，菌丝稀疏，培养1周形状似抢靶心，反面中间橘红色，有隔菌丝。

（5）J～05菌落棉絮状，正面浅白色，气生，疏松，边缘整齐，背面黄色，培养几天后菌落表面呈水质状，同心环圆，颜色不一，菌丝有隔，产生镰刀状的分生孢子。

（6）J～06菌落正反面中间呈橘红色、边缘米黄色，菌落扁平，菌丝紧密，边缘菌丝呈绒毛状，菌落边缘不整齐，有隔菌丝，锐角分枝。

（7）J～07菌落扁平，菌丝棉絮状，较紧密，正反面呈白色，边缘整齐，菌丝有隔，产生大量镰刀状的分生孢子。

（8）J～08菌落正反面呈白色，平坦，菌丝较短，紧贴着培养基表面生长，边缘整齐，菌丝锐角分枝。

（9）J～09菌落正反面中间呈黑色、边缘白色，菌落表面平坦，菌丝较短，生长月10天后，菌落正面灰绿色，反面蓝绿色，菌丝分枝，网状排列。

（10）J～10菌落正反面呈白色，菌落平坦，形状不规则，菌丝较短，菌丝有隔，树枝状分枝。

（11）J～11菌落正反面乳白色，细绒毛状菌丝，菌丝稀疏，有隔菌丝，不规则网状结构排列。

2.2.2 菌株的生长速率

真菌的生长速度是真菌的重要生物学特性之一，不同的菌株在相同的培养基及培养条件下，具有不同的生长速度，测定其生长速率，在真菌的分类鉴定上具有较为重要的意义。该次测定将分离出的11种菌株均接种至PDA培养基上，放置于相同的环境条件下进行培养， 以获取不同菌株的生长速率，为真菌菌株的鉴定提供依据。菌株PDA培养基上生长速度详见图2和图3。

图2 部分菌根真菌在PDA培养基上生长速度曲线

图3 部分菌根真菌在PDA培养基上生长速度曲线

图4 部分菌根真菌在PDA培养基上生长速度曲线

从图表中可以看出，除J～01菌株生长迅速与J～10菌株生长较为缓慢外，大多数菌株在10～18天内均可长满整个培养皿，表明不同的菌株间具有不同的生物学特性，并且各菌株在不同的生长阶段里，其生长速度也不完全稳定，这可能与菌种本身的生长机制和培养条件的差异性有关。

2.2.3 菌株形态初步鉴定

该次实验主要以菌落的形态特征、菌丝、显微结构及产孢结构为主要鉴定依据，对卷萼兜兰菌根真菌进行了分类鉴定。对从卷萼兜兰根中分离出来的11株真菌进行鉴定，初步得出下列结论：在11个供试菌株中，有两个菌株鉴定结果待定，其余菌根只鉴定到属，鉴定结果见表1。

表1 菌株鉴定结果

3 讨论

表面消毒试剂及不同时长处理,对内生真菌的分离也有很大影响。材料消毒措施的力度 (消毒剂的杀菌力、使用浓度、消毒时间等)越大,灭菌就越彻底,污染力越低。但是消毒剂对植物组织细胞都是有毒的,因此会造成组织细胞损伤严重，成活率也就越低。该试验过程中，表面灭菌采用NaClO较HgCl2溶液的毒性小，且筛选获得分离效果很好的消毒时间，因此该方法进行表面消毒适用于该材料。由于在相关文献中报道在根基和根尖中存在的内生真菌较少,所以在取材时也应注意尽量选取根中部的材料做试验。

分离得到菌根真菌的培养过程观察发现，卷萼兜兰内生真菌不同种类的生长情况存在较大差异性。J～01仅3天可长满整个培养皿，J～10则需26天才会长满，这可能由真菌本身的生长特性或者这种菌的种群数量决定。可开展卷萼兜兰的菌根真菌共生萌发和回接实验，筛选其优势菌株，对菌根真菌代谢产物进行研究以便深入了解菌根真菌促进兰科植物生长发育的生理生化机理，为两者间专一性关系打下基础。从卷萼兜兰的根中分离并初步鉴定得到3个菌种属于镰刀菌属，这与相关报道中镰刀菌占优势一致，与其他兰科植物的菌根特征一样，该镰刀属真菌可能为卷萼兜兰菌根的优势菌种。

兰科菌根真菌的分类和鉴定目前还主要依靠形态学方法，该研究分离到的真菌只鉴定到属而没有鉴定到种，是因为兰科植物菌根真菌的鉴定比较复杂，菌根的同源性较高。近年来，分子生物学技术得到了快速发展，很多菌物鉴定工作都引入了分子生物学鉴定方法。分子生物学能够对形态分类学起到客观的评价作用，菌根真菌的研究也引入分子生物学的技术手段，传统的形态学方法和分子手段相结合能将菌株鉴定到种，使鉴定结果更加准确可靠。