卷柏炒炭前后对小鼠出血时间和凝血时间的影响*

杨瑞芳，吴宿慧，魏术会，张振凌，李寒冰，李根林(.河南中医学院第二附属医院药学部，河南 郑州 45000; .河南中医学院药学院，河南 郑州 450046)

·实验研究·

卷柏炒炭前后对小鼠出血时间和凝血时间的影响*

杨瑞芳1，吴宿慧2，魏术会2，张振凌2，李寒冰2，李根林2
(1.河南中医学院第二附属医院药学部，河南 郑州 450002; 2.河南中医学院药学院，河南 郑州 450046)

目的：对照研究卷柏炒炭前后对小鼠出血时间和凝血时间的影响，为进一步探讨卷柏炮制前后作用机制的研究提供前期的实验基础。方法：昆明种小鼠随机机分为生理盐水组、卷柏生品低剂量组、卷柏生品高剂量组、卷柏炭低剂量组和卷柏炭高剂量组5组，每组10只。将卷柏生品、卷柏炭分别制成1，0.5 g /mL两种质量分数的药液。各给药组灌胃相应药液，给药剂量为20 μL/g,连续给药3 d，1 d 1次。生理盐水组灌胃等体积的生理盐水作为对照。采用剪尾法取血，采用玻璃毛细管法和玻片法分别测定卷柏炭灌胃后对小鼠出血时间和凝血时间的影响。结果：与生理盐水组对比，卷柏生品高剂量组出血时间、凝血时间延长，差别有统计学意义(P<0.05)。卷柏炭低剂量组与生理盐水组、卷柏生品低剂量组对比，出血时间、凝血时间减少，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。卷柏炭高剂量组与生理盐水组、卷柏生品高剂量组对比，出血时间、凝血时间减少，差别有统计学意义(P<0.01)。卷柏炭高剂量组与卷柏炭低剂量组对比，出血时间、凝血时间有所减少，但差别无统计学意义 (P>0.05)。结论：卷柏生品具有抗凝血作用；卷柏炭具有促凝血作用，且随着浓度的增加，效果更显著。

卷柏；卷柏炭；出血时间；凝血时间；动物；小鼠

卷柏为蕨类卷柏科(Selaginellaceae)卷柏属(Selaginella)植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginellapulvinata(HooK.et Grev.)Maxim.的干燥全草[1-2]，又名长生不死草、九死还魂草等[3]。卷柏性味辛、平，归肝、心经，早在《本经》中即有记载，被列为上品，述其“主治五脏邪气，女子阴中寒热痛，癥瘕血闭绝子”。 卷柏生用具有活血通经、破血散结之功效，用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤；炒炭后可化瘀止血、用于吐血、崩漏、便血、脱肛[4]。中医学认为：卷柏生用活血，炒炭止血。《本草求真》云:“卷柏，其治有分生熟。生则微寒，力能破血通经，故治症瘕淋结等症；炙则辛温，能以止血，故治肠红脱肛等症。”《日华子本草》云:“生用破血，炙用止血。”[5]。《本草述》也有“烧存性”入药的记载。现卷柏多炒炭用于止血，但有关卷柏炒炭后止血作用的研究尚少。本文对照研究了卷柏炒炭前后经灌胃给药对小鼠凝血时间的影响，以期对卷柏制炭后促进凝血的作用机制的研究提供前期的实验基础。

1 材料与方法

1.1 动 物

昆明种小鼠50只，体质量18～22 g，雌雄各半，河南实验动物中心提供，合格证号：SCXK(豫)2010-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

卷柏生品，购自河南省郑州市本草国药馆，经河南中医学院陈随清教授鉴定为卷柏科卷柏属植物卷柏[S.tamariseina(Beauv.)Spring]；卷柏炭，河南中医学院炮制实验室自行炮制。9 g/L生理盐水,山东齐都药业有限公司产品，批号20140926。BSA-220.4型电子称，上海卓精电子科技有限公司产品；DZF-6050型真空干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；ST2106电磁炉，美的集团产品；扬帆牌载玻片(25.25 mm×75.25 mm)，盐城市盐都区潘黄镇文礼玻璃仪器厂产品；玻璃毛细采血管(内径1 mm ，长100 mm)，华西医科大学仪器厂产品；其余小鼠灌胃器、手术剪、电子计时钟、滤纸、注射用针头等为常规实验室用品。

1.3 药品的制备

1.3.1 卷柏炭的制备

参照文献方法[6]，取洁净的卷柏，置锅内用武火炒至外表焦黑色，内呈焦黄色，喷淋清水，取出，晒干。

1.3.2 两种不同质量分数卷柏生品药液的制备

将药材洗净，切成1 cm段，置烘箱中50 ℃干燥，称量100 g。煎煮2次，第1次加10倍量水煮沸30 min，第2次加8倍量水煮沸20 min，合并煎液，过滤，浓缩成100 mL的药液，即得质量分数为1 g /m L药液。另称量50 g，同法制得质量分数为0.5 g/mL卷柏生品药液。

1.3.3 两种不同质量分数卷柏炭药液的制备

取卷柏炭，称量100 g。煎煮2次，第1次加10倍量水煮沸 30 min，第2次加8倍量水煮沸20 min,合并煎液，过滤，浓缩成100 mL的药液，即得质量分数为1 g/mL药液。另称量50 g，同法制得质量分数为0.5 g/mL卷柏炭药液。

1.4 动物分组与给药

将50只小鼠随机分为生理盐水组、卷柏生品低剂量组、卷柏生品高剂量组、卷柏炭低剂量组和卷柏炭高剂量组5组，每组10只。各给药组分别灌胃相应药液，给药剂量为20 μL/g,连续给药3 d，1 d 1次。生理盐水组灌胃等体积的生理盐水作为对照。

1.5 检测指标

1.5.1 出血时间

采用剪尾法[7]：末次给药1 h后，将小鼠驱入固定器中，露鼠尾于外，用剪刀剪去尾尖约3 mm，血自行溢出时开始计时。每隔20 s用滤纸轻轻吸取血滴1次，至以滤纸吸时滤纸上没有血滴产生为止，所历时间为出血时间。

1.5.2 凝血时间

分别采用玻璃毛细管法[8-10]和玻片法[8-10]测定。玻璃毛细管法：末次给药1h后，立刻以玻璃毛细管插入刚被剪尾处理的小鼠左眼内眦球后静脉丛，从血液流入玻璃毛细管内开始计时，血液注满后将玻璃毛细管平放于桌上 ，每隔 20 s折断毛细管0.5 cm,并缓慢向左右拉开 ，观察折断面是否有血凝丝,至血凝丝出现为止,所历时间即为凝血时间。玻片法：末次给药1 h后，毛细管取血，将毛细管中的血液滴2滴于载玻片两端，血滴直径 5～6 mm，开始计时，每隔 20 s用清洁针头轻挑血丝1次，观察有无血丝挑起，至挑起血丝止，所历时间即为凝血时间。另一滴血供复检。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件处理。数据以均数(x)±标准差(s)表示。均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布时进行单因素方差分析，非正态分布进行非参数检验。多组间比较用ANOVA分析，再用LSD进行多组比较。以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠出血时间对比

与生理盐水组对比，卷柏生品高剂量组出血时间增加，卷柏炭高、低剂量组出血时间减少，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。卷柏炭高、低剂量组与生品相应剂量组对比，出血时间明显减少，差别有统计学意义(P<0.01)。与卷柏炭低剂量组对比，高剂量组出血时间虽减少，但差别无统计学意义 (P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠出血时间对比n=10,x±s

注:与生理盐水组对比，**P<0.05，***P<0.01 ；与卷柏生品相同质量分数组对比，##P<0.01；与卷柏炭高剂量组对比，△P>0.05。

2.2 各组小鼠凝血时间对比

玻璃毛细管法和玻片法测定结果一致：与生理盐水组对比，卷柏生品高剂量组凝血时间延长，差别有统计学意义(P<0.05)。与生理盐水组、生品低剂量组对比，卷柏炭低剂量组凝血时间缩短，差别有统计学意义(P<0.05)。与生理盐水组、生品高剂量组对比，卷柏炭高剂量组凝血时间减少，差别有统计学意义(P<0.01)。与卷柏炭低剂量组对比，高剂量组凝血时间有所减少，但差别无统计学意义 (P>0.05)。见表2、表3。

表2 玻璃毛细管法所测各组小鼠凝血时间对比n=10,x±s

注：与生理盐水组对比，**P<0.05，***P<0.01；与卷柏生品相同质量分数组对比，##P<0.05，###P<0.01；与卷柏炭高剂量组对比，△P>0.05。

表3 玻片法所测各组小鼠凝血时间对比n=10,x±s

注：与生理盐水组对比，**P<0.05，***P<0.01；与卷柏生品相同质量分数组对比， ##P<0.05 ###P<0.01；与卷柏炭高剂量组对比，△P>0.05。

3 讨 论

出血是指因凝血系统障碍而发生的出血现象,为临床的常见症状，中医较早称之为“血症”。止血中药较多[11]，炭药是其中的佼佼者，因中药在制炭后常增加其收敛与吸附作用,有利于止血。卷柏,生则破血通经,炙则化瘀止血。本实验结果显示：卷柏生品水煎液能明显延长小鼠的凝血时间和出血时间,具有抗凝血作用；而卷柏炭品能够明显缩短小鼠的凝血时间和出血时间。结果表明：卷柏炒炭后确实有明显的止血作用。本实验中玻璃毛细管法所测凝血时间与玻片法所测凝血时间基本一致,说明该实验结果可靠、可信。此外，尽管没有统计学意义上的差别，但卷柏炭高剂量组比低剂量组凝血用时短，表现出更强的促凝效果，与生理盐水组和同质量分数的卷柏生品相比，差异更显著，说明在一定浓度范围内，药液质量分数对卷柏的促凝血活性有一定影响。

制炭为我国传统的炮制工艺, 炭药可增强收敛、止血之功,可降低毒性、缓和药性等，其止血的机制非常复杂,往往并非由单一因素发挥作用的,主要是通过抑制抗凝血因子的产生或者增强体内凝血因素而促进凝血[12]。化瘀止血炭药主要用于瘀血阻滞、血不循经而外溢的各种出血症，卷柏炭作为临床常用的化瘀止血炭药炒炭后止血效果增强，其化学成分的种类、数量，与止血相关的药性、药效及临床应用和各个药理环节也发生了不同程度的改变[13]。

为了能更正确地运用炮制技术、规范饮片质量、指导临床用药和新药的开发[14-15]，需多学科多角度研究中药炭药止血的作用机制，对炭药止血理论不断加以充实、完善，以利于中医药产业的现代化，推动中医药事业的发展，此是中药现代化的发展趋势[16]。

[1]郑晓珂,李玉洁,张莉,等. 卷柏对2型糖尿病大鼠模型葡萄糖代谢影响的实验研究[J]. 现代预防医学,2009,36(10):1918-1922.

[2]贺光东. 卷柏活性成分研究[D].开封：河南大学,2009.

[3]郑晓珂,张鑫,王小兰,等. 卷柏提取物改善高脂血症大鼠肝脏脂肪变及肝脏保护作用的实验研究[J]. 中国新药杂志,2010,19(14):1216-1221.

[4]郑玉胜. 中药卷柏化学成分和质量标准研究[D].北京：北京中医药大学,2007.

[5]张昊.兖州卷柏成分及抗肿瘤活性成分研究[D].长沙：中南大学,2009.

[6]李根林,魏术会,张振凌，等.卷柏不同炮制品总黄酮含量比较[J].中医学报,2011,26(2):194-195.

[7]李娴,卫向龙,李凯，等.生地黄炭及熟地黄炭对小鼠出、凝血时间的影响[J].中华中医药杂志,2013,28(4):927-929.

[8]何 红,车庆明,孙启时.地龙提取物的抗凝血作用[J].中草药,2007,38(5): 733.

[9]杨秀芬,周芳,李丽花,等.桂郁金水提物对小鼠出血与凝血时间的影响[J].时珍国医国药,2010,21(9):2425-2426.

[10]曲香芝,崔弘,陈正爱.不同炮制法的淫羊藿提取物对小鼠出血和凝血时间的影响[J].时珍国医国药,2007,14(1): 118.

[11]王星.止血中药及复方的实验研究与作用机制探讨[J].内蒙古中医药,2014,81(29):101.

[12]刘世旺,徐艳霞,徐霞玲,等.墨旱莲叶水提取物止血活性初探[J].安徽农业科学,2008,36(31):13673-13674.

[13]孔祥鹏,陈佩东,张丽,等.化瘀止血炭药止血机理现代研究进展[A].中华中医药学会.2010中药炮制技术、学术交流暨产业发展高峰论坛论文集[C].中华中医药学会,2010:4.

[14]杨星辰,俞培忠.中药炒炭止血作用的研究进展[J].上海医药,2009,30(7):326-328.

[15]包贝华,张丽,丁安伟.中药止血成分的研究进展[J].中草药,2009,40(8):1324-1327.

[16]陈溪,李书渊,朱少旋.止血中药的研究进展[J].中国医药指南,2012,10(3):58-60.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0070-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.32

李根林，教授，河南中医药大学图书馆，lhb8899@163.com

金水区技术研究与开发经费支持项目[金科(2011)31号 项目序号：45]

2015-05-19；

2015-10-20