补肾醒脑方对血管性痴呆大鼠胆碱能抗炎通路的影响*

胡久略，郅 琳，卞 华，丁吉善，杨淑慧 (.河南省宛西制药股份有限公司，河南 南阳 474550； .南阳理工学院张仲景国医学院，河南 南阳 473004 )

·实验研究·

补肾醒脑方对血管性痴呆大鼠胆碱能抗炎通路的影响*

胡久略1，郅 琳2，卞 华2，丁吉善2，杨淑慧2
(1.河南省宛西制药股份有限公司，河南 南阳 474550； 2.南阳理工学院张仲景国医学院，河南 南阳 473004 )

目的：观察补肾醒脑方对血管性痴呆大鼠胆碱能抗炎通路的影响，探讨其对血管性痴呆大鼠脑保护作用机制。方法：将Wistar大鼠随机分为假手术组、模型对照组、补肾醒脑方组、喜德镇组4组，每组10只。均灌胃给药，术前每天1次进行预防性给药1周, 术后24 h继续给药，1 d 1次，连续7 d，模型对照组和假手术组给予蒸馏水(5 mL/d)灌胃，补肾醒脑方组给予补肾醒脑方灌胃，喜德镇组给予喜德镇灌胃。于术后的第2天、第4天、第6天测试各组大鼠的学习记忆能力；选取脑缺血再灌注24 h后为观察点，采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量，采用比色法测定ChAT、AchE活性。结果：补肾醒脑方治疗组IL-1β、TNF-a和IL-10、TGF-β表达较模型对照组降低(P<0.05)，补肾醒脑方治疗组AchE活性较模型对照组降低(P<0.05)，补肾醒脑方治疗组ChAT的活性较模型对照组明显提高(P<0.05)；补肾醒脑方治疗组IL-1β、TNF-α表达较假手术组增高(P<0.05)；模型对照组IL-1β,TNF-α表达较假手术组显著增高(P<0.01)；在控制其他因素不变的条件下，IL-1β与AchE呈正相关(r=0.94，P=0.000)，与ChAT呈负相关(r=-0.93，P=0.002)；TNF-a与AchE呈正相关(r=0.92，P=0.003)，与ChAT呈负相关(r=-0.91，P=0.004)。结论：促炎因子TNF-a、IL-1β和抗炎因子TGF-β、IL-10在缺血性脑损伤中具有重要作用，Ach可抑制致炎细胞因子释放。补肾醒脑方可作用于胆碱能抗炎通路，能够缓解血管性痴呆大鼠迷走神经受到的阻抑作用，使Ach的合成增加，抑制炎性反应，减轻脑组织的损伤。

血管性痴呆；补肾醒脑方；胆碱能抗炎通路；肿瘤坏死因子a；白介素-1β；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶；动物；大鼠

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是老年人的常见病和多发病，是老年期痴呆的主要类型之一。中医药对血管性痴呆具有较好的疗效优势。补肾醒脑方是临床治疗VD的有效方剂，具有化痰祛瘀、补肾益气、醒脑开窍之效。前期研究发现本方对VD 疗效肯定，能提高VD大鼠的学习记忆能力，改善脑组织的病理形态，其机制与改变氨基酸类神经递质的含量、抑制细胞的凋亡、改善自由基的代谢等有关[1-7]。本研究采用比色法检测脑组织AchE、ChAT的活性，研究VD大鼠脑组织AchE和ChAT的变化及其与TNF-a、IL-1β和IL-10、TGF-β相关性，探讨该方对VD大鼠胆碱能抗炎通路(CAP)的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

成年雄性4月龄Wistar大鼠40只，普通级，体质量190～250 g，购自郑州大学实验动物中心，合格证号：医动字第20-012号。

1.2 药品、试剂与仪器

补肾醒脑方组成：熟地黄12 g，制首乌12 g，女贞子12 g，人参9 g，丹参9 g，川芎9 g，赤芍9 g，石菖蒲6 g，远志6 g，天麻6 g等。药品购入后经南阳理工学院中药教研室鉴定。制备方法：药物以总体积的5倍量水冷浸3 h，微沸1 h×2次，合并滤液，文火浓缩成质量分数为3 g/mL的浓缩液，无菌条件下装瓶，放置4 ℃冰箱备用。喜得镇(批号140311),天津华津制药厂产品，用生理盐水配制成0.03 g/L的药液备用。 AchE试剂盒(批号20131221)、ChAT试剂盒(批号20130605)、考马斯亮兰蛋白试剂盒(批号20130730)，均由深圳晶赛生物技术有限公司提供。722型可见光分光光度计，上海菁华科技公司产品；400R低温离心机，北京昊诺斯科技公司产品；高速冷冻离心机，上海强智生物科技公司产品；DY89-1电动玻璃匀浆机，上海新诺仪器设备公司产品；Multiskan MK3型酶标仪，上海甘薇生物科技公司产品；低温冰箱，南京伯乐公司产品；显微照相机，深圳市海量光电公司产品；轮转式切片机，上海之信仪器公司产品；光学生物显微镜，上海长方仪器厂产品。

1.3 动物的筛选

大鼠适应性喂养1周后，采用穿梭箱主动回避反应系统训练筛选。此系统用灯光作为刺激，足底电击作为非条件刺激。若大鼠在灯光刺激情况下即可完成穿梭动作称之为主动回避反应(AAR)，而经电刺激后方能够完成穿梭动作称之为被动回避反应(PAR)。大鼠的记忆学习能力以能够完成主动回避反应(AAR)次数与测试总次数(20次)的比值，即被动回避反应(PAR)习得率来表示。大鼠在模型制作前皆要经过穿梭箱训练7 d，AAR习得率大于/等于80%者方能入选。

1.4 VD模型的建立

采用高脂饮食法[8]以及猫吓鼠法[9]制作肾虚痰瘀模型[10]：将大鼠笼放在猫笼下面，中间用一层铁丝网隔开，猫有时候可以接触到大鼠。同时反复播放凶狠的猫叫声音录音磁带。于每天上午9：00-11：00、下午15：00-17：00恐吓大鼠，共计1个月。同时喂食大鼠高脂饲料20 g(0.5%胆酸钠，81.3%普通饲料，0.2%丙基巯氧嘧啶，10%猪油， 3%胆固醇， 5%白糖)，火腿肠14 g，连续喂养1个月。

肾虚痰瘀模型成功后，制作VD大鼠模型[11-13]：灌胃到第30天，在给药1 h后，大鼠用100 g/L 的水合氯醛腹腔注射(350 μg/g)麻醉，仰卧固定在手术台之上，常规消毒后，颈正中部切口，快速分离双侧的颈总动脉，穿线以备用。同时以 3.5 μg/g的剂量经腹腔注射硝普钠用以造成低血压，然后使用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，如此反复操作3次，再通后缝合大鼠伤口，放回到笼中继续饲养。第2天继续灌胃。假手术组仅分离颈总动脉，不注射硝普钠，亦无双侧颈总动脉反复夹闭。术后立即注射青霉素16 U/g预防感染。

模型成功标准：缺血再灌注术后2～6 h内观察大鼠的功能及躯体感觉，按照5分制神经病学评分标准[14]实施评分。0分：无神经方面的损伤症状。1分：不能完全伸展开对侧的前爪与后爪。2分：能向手术对侧进行转圈。3分：能向手术对侧进行倾倒。4分：丧失意识，不能进行自发行走。1分及1分 以上者视为模型成功，少于1分者视为未成功。未成功者弃去。

1.5 动物分组与给药

将筛选合格的40只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型对照组、补肾醒脑方组、喜德镇组4组，每组10只，每笼5只。大鼠自由觅食饮水，在室温22 ℃～25 ℃、湿度45%左右环境下喂养。各组均灌胃给药，术前每天1次进行预防性给药1周, 术后24 h继续给药。模型对照组和假手术组给予蒸馏水灌胃， 5 mL/d；补肾醒脑方组给予补肾醒脑方灌胃；喜德镇组给予喜德镇灌胃。给药剂量均按照体质量进行换算[15]，1 d 1次，连续7 d。

1.6 检测指标

1.6.1 学习记忆能力测试

使用穿梭箱主动回避反应系统，每一组大鼠于术后的第2天、第4天、第6天进行测试。

1.6.2 脑组织ChAT、AchE活性

采用比色法进行ChAT、AchE活性测定。取大鼠海马组织的上清液，加入到反应体系之中检测酶的活性。空白管、标准管、测定管分别加入试剂，然后混合均匀，以3 500 r/min离心10 min，取其上清液，于520 nm和1 cm光径进行比色，空白管调为零，检测各管的吸光度，根据颜色的深浅以比色定量。

1.6.3 大鼠脑组织IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量

采用酶联免疫吸附法检测。于造模成功后第7天将大鼠断头，取左侧大脑的半球，在冰台上快速去掉小脑、脑干和嗅脑，用冰生理盐水冲洗干净，吸干后称取脑组织质量并放置于-20 ℃冰箱内保存。将待测的组织样品从低温冰箱内取出至室温复苏，按组织样品与生理盐水9∶1的比例，制备成质量分数为100 g/L的脑组织匀浆，2 200 r/min离心10 min，取上清脑组织匀浆以备待测。将试剂盒在室温下放置40 min，试剂在使用前轻轻地摇均匀；新鲜的双蒸水和浓缩洗涤液皆1∶20倍稀释，混合均匀后于室温下放置备用。按照试剂盒提供的方法进行检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计分析软件处理。数据以均数(x)±标准差(s)表示。每组数据先进行方差齐性检验和正态分布，多组间的差异显著性检验采用单因素方差分析，多组间两两之间比较采用LSD检验。以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠穿梭箱AAR习得率成绩对比

模型对照组大鼠第2天AAR习得率明显低于对照组；第4天、第6天时进一步降低，与假手术组对比，差别均有统计学意义均(P<0.01)。中药治疗组各时间点AAR习得率较模型对照组同时间点显著增高，差别有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠穿梭箱AAR习得率成绩对比n=10，x±s

注：与假手术组对比，*P

2.2 各组大鼠脑组织AchE、ChAT活力对比

脑缺血再灌注24 h后,模型对照组大鼠海马组织AchE活性稍有升高，提示血管性痴呆模型造成了乙酰胆碱代谢异常；两给药组皆能显著抑制血管性痴呆大鼠AchE活性 (P<0.05),但两组之间对比，差别无统计学意义(P>0.05)。大鼠脑缺血再灌注24 h后,模型对照组大鼠ChAT的活性显著降低(P<0.01)；两给药组皆能显著改善血管性痴呆大鼠ChAT的活性，但两组对比差别无统计学意义(P>0.05)。此提示药物能够促进乙酰胆碱在脑内的合成代谢；见表2。

表2 各组大鼠脑组织AchE、ChAT活力对比 U·mg-1，x±s

注:与假手术组对比，*P<0.05,**P<0.01；与模型对照组对比, #P<0.05。

2.3 各组大鼠脑组织TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β含量的影响

脑缺血再灌注7 d后，模型对照组大鼠脑组织中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的含量均明显增高(P<0.01)。两治疗组均能够不同程度地降低促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的含量，对VD大鼠的炎性反应具有显著的抑制作用，但两组间对比，差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织IL-1β、TNF-α含量对比 ng·gpr-1，x±s

注：与假手术组对比，*P<0.05, **P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05#,##P<0.01。

脑缺血再灌注7 d后，模型对照组大鼠脑组织抗炎细胞因子TGF-β、IL-10的含量皆有一定程度地增高。两治疗组均可不同程度地降低抗炎细胞因子TGF-β、IL-10的含量，但两组间对比，差别无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织IL-10、TGF-β含量对比 ng·gpr-1，x±s

注：与假手术组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.4 ChAT及AchE与IL-1β及TNF-α相关性分析

在控制其他因素不变化的条件下，IL-1β与AchE呈正相关(r=0.94，P=0.000)，与ChAT呈负相关(r=-0.94，P=0.003)；TNF-a与AchE呈正相关(r=0.92，P=0.003)，与ChAT呈负相关(r=-0.91，P=0.004)。见表5。

表5 ChAT及AchE与IL-1β及TNF-α相关性分析

3 讨 论

炎性反应产生的炎性细胞因子可以通过无血脑屏障的室周器官进入脑，或由孤束核、迷走背核感受后上行进入中枢。研究表明：神经系统能够通过迷走神经快速、显著地抑制巨噬细胞释放促炎细胞因子，减轻炎性反应的发生，这一作用机制称之为“胆碱能抗炎通路”[16]，是一种神经—免疫调节通路，可以高效地反馈调节、监测炎性反应，通过释放Ach，抑制促炎因子的释放，具有直接、快速、整合、局限、早期调节炎性反应的特点[17-19]。胆碱能抗炎通路的激活可以有效减少诸种促炎细胞因子的释放，对局部和全身的炎性反应均有显著的阻抑作用。

细胞因子是脑缺血/再灌注炎性反应中非常重要的炎性免疫因子。根据在炎性反应中的作用将其分为抗炎因子(IL-1ra、TGF-β、IL-6 、IL-10等)和促炎因子(IL-1β、IL-8 、TNF-α等)两大类。研究表明：在脑缺血/再灌注应激状况下，炎性细胞因子会率先诱导产生，其中主要是促炎因子IL-1β和TNF-α，然后会引发局灶性的内皮细胞、星形胶质细胞血管周围细胞与神经元发生炎性反应，并会刺激其他细胞因子和炎性介质的产生，诱导损伤区白细胞浸润，以及小胶质细胞的激活。细胞因子能刺激白细胞与内皮细胞的粘附、细胞粘附分子的产生，最终能够使内皮细胞转化为血栓前或炎症前的状态，白细胞则向炎症性病灶区域聚集；炎性免疫细胞与细胞因子亦可相互激活，通过错综的“细胞因子网络”系统调节诸多细胞的功能，产生过量的炎性反应，如此不仅可以影响及局部的血液供应，而且可直接破坏细胞组织的结构，进一步加重缺血区的脑组织的损伤[20]。

脑缺血再灌注常伴有炎性反应，在炎性细胞反应发生之前有介导炎性反应的细胞因子的表达。IL-1β、TNF-α是脑缺血性/再灌注损伤所诱发的起始调节因子，可以引发诸多反应通路，在缺血/再灌注脑损伤过程中具有非常重要的作用； IL-10、TGF-β作为抗炎因子在脑缺血/再灌注损伤中亦具有重要作用。

目前已知，AchE为Ach之水解酶，ChAT为Ach之合成酶，其血清或脑组织含量能够反映Ach的含量。本研究结果发现：与假手术组对比，模型对照组脑组织中IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10和AchE均显著升高，脑组织中ChAT明显降低；其相关性分析则提示IL-1β与ChAT呈负相关，与AchE和TNF-α与呈正相关。此则表明VD发生后Ach的合成明显减少，迷走神经被抑制，炎性反应进一步加重。

补肾醒脑方由地黄饮子加减化裁而来，具有化痰祛瘀、补肾益气、醒脑开窍之功。该实验结果发现：补肾醒脑方组脑组织AchE较模型对照组低，ChAT较模型对照组高，TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β较模型对照组低，提示该方作用于迷走神经—胆碱能抗炎通路，对血管性痴呆大鼠迷走神经起到了抑制作用，使Ach的合成增加，减轻了炎性反应，从而能够减少缺血/再灌注后脑组织的损伤。

综上所述， 胆碱能抗炎通路在VD模型大鼠的生理病理中有着非常重要作用。补肾醒脑方可以通过调节其功能，显著减轻炎性反应，抑制脑组织的损伤，但其深入的作用机制仍待进一步研究。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0066-05

R749.1+3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.31

胡久略(1977-)，男(汉族)，河南信阳人，副教授，中医学博士，河南省宛西制药股份有限公司在站博士后，在南阳理工学院张仲景国医学院主要从事方剂学教学与临床工作，主要研究方向：方剂配伍规律、疗效机理及中医药防治脑病的研究。

河南省科技厅科技公关计划项目(152102310224)

2015-06-12;

2015-10-08