党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾细胞DNA和组织结构的影响*

耿广琴，李能莲,刘 卉，杨雅丽，黄 勇 (.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000； .甘肃中医药大学附属医院检验科，甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾细胞DNA和组织结构的影响*

耿广琴1，李能莲1,刘 卉2，杨雅丽1，黄 勇1
(1.甘肃中医药大学基础医学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医药大学附属医院检验科，甘肃 兰州 730000)

目的: 研究党参水提物对衰老模型小鼠肝、肾DNA和肝、肾组织结构的影响，探讨党参保肝、护肾、抗衰老的机制，为中医药延缓衰老提供科学依据。方法: 将100只小鼠随机分为正常对照组、模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组5组。模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组每日每只小鼠颈背部皮下注射质量分数50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g；正常对照组注射同体积量生理盐水。3个党参治疗各组每日上午按相当于生药量5，10，15 g/kg 3个剂量给致衰老小鼠灌服党参水煎液，与造模同步，连续服药42 d。采用单细胞凝胶电泳检测肝、肾细胞DNA损伤，石蜡切片法观察肝、肾组织结构变化。结果：给予10,15 g/kg党参水提物后，小鼠肝肾细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。模型对照组肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，胞浆疏松化，细胞变性，炎细胞浸润明显；肾小球萎缩，肾小管上皮细胞肿胀、变性或坏死，灶状小管萎缩，肾间质呈现明显的纤维化病变。给予党参水提物后，高剂量组肝细胞变性明显改善，炎性浸润显著减轻；肾小球萎缩明显缓解，肾小管上皮细胞肿胀、变性减轻，肾间质纤维化病变也明显缓解。结论: 党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过减轻肝、肾细胞DNA损伤，减缓衰老致肝、肾组织结构退行性病变，达到延缓衰老的作用，而更深入的机制探讨尚需进一步研究。

党参水提物/药效学；衰老/药物作用；D-半乳糖致衰老模型；DNA损伤；组织结构变化；动物；小鼠

衰老是生命过程中的一个必然阶段。虽然导致和影响衰老的因素很多，但是，五脏是生命活动的中心，五脏生理功能正常则生命活动就正常，从而维持机体健康与长寿；反之，如果五脏虚损，生理功能失常，生命活动就失常，进而影响健康与寿命；因此，衰老是五脏虚损共同作用的结果[1]。肝主疏泄，调节气机，是保持机体气机正常升降出入的重要脏腑[2]。肾为先天之本，肾主藏精，对机体的生长、发育和衰老起着决定性的作用[3]。由此可见，在五脏之中，肝肾虚损与衰老的关系极为密切，故研究肝脏、肾脏衰老的机制和延缓肝、肾二脏衰老具有重要意义。本实验利用D-半乳糖致衰老模型小鼠为对象，研究党参水提物对衰老模型小鼠肝、肾DNA及肝、肾组织结构的影响，探讨中药党参保肝护肾抗衰老的机制，为中医药延缓衰老提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级2月龄昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量(18±2) g，购自甘肃中医学院科研实验动物中心，合格证号: SCXK(甘) 2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

党参，采自甘肃岷县，经甘肃中医药大学中药学教研室鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并两次提取液，过滤后浓缩成质量分数为0.5 g/mL的水煎剂，置4 ℃冰箱备用，水煎液每 5天制备1次。D-半乳糖，美国Sigma公司产品，批号063K0044，临用前用生理盐水配制成12 g/L备用；正常熔点的琼脂糖(批号090M01452A)、低熔点的琼脂糖(批号090M01549V)，均为美国Sigma公司产品；台盼兰、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二甲基亚砜(DMSO)、溴化乙锭(EB)等，均为国产分析纯。BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；HH-4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品；XYJ80-20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品；XW-80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品；DYY-Ⅲ型电泳仪，北京六一厂产品；CKX41-F32FL荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯公司出品；CX31-12C04光学显微镜，日本奥林巴斯公司出品。

1.3 动物分组与模型的建立

将100只小鼠随机分为正常对照组，模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组5组，每组20只，雌雄各半。模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组每日每只小鼠颈背部皮下注射质量分数50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g，正常对照组注射等体积生理盐水。党参治疗各组每日上午按相当于生药量5，10，15 g/kg 3个剂量给致衰老小鼠灌服党参水煎液，与造模同步，连续服药42 d。

1.4 检测指标

于末次给药2 h后，称量各组小鼠体质量，断头处死小鼠，迅速剖取肝、肾，用预冷的4 ℃生理盐水洗净表面残血备用。

1.4.1 DNA损伤

采用单细胞凝胶电泳检测。用37 ℃的PBS缓冲液冲洗肝、肾组织，分别匀浆，加适量PBS悬浮细胞，收集细胞悬液于1.5 mL的ephendorf管中，静置下沉3 min，将上部悬液转至另一个ephendorf管中，800 r/min离心5 min，弃上清，用PBS将细胞浓度调整至104～105个/mL。台盼兰检测细胞活率，大于90%方可进行实验。单细胞凝胶电泳按照Singh[4]描述的方法稍加改进，将5 g/L的正常熔点的琼脂糖液100 μL铺展到有磨痕的载玻片上，自然风干，作为第1层胶；取正常熔点7 g/L琼脂糖100 μL，铺第2层胶；去掉盖玻片后加入制备的细胞悬液(细胞悬液体积∶5 g/L的低熔点琼脂糖溶液体积=1∶8)100 μL铺展到载玻片上作为第3层。将载玻片浸入新配置的4 ℃预冷裂解液，裂解2 h，电泳液中解旋30 min，25V，300 mA电泳30 min。电泳完毕后用48.4 g/L Tris-HCl缓冲液中和，EB染色，荧光显微镜下观察，拍照。选择尾长、尾矩和Olive尾矩作为DNA损伤指标。尾长即沿电泳方向“彗星”尾部最远端与头部中心之间的距离， 尾矩即尾部DNA占总DNA的百分比与头、尾部光强度重心间距的乘积， Olive尾矩即从头部光密度重心到尾部光密度重心的距离与尾部DNA含量的乘积。

1.4.2 肝、肾组织结构

采用石蜡切片法。肝、肾脏组织用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片(厚度7μm)，HE染色，光镜下观察，拍照，MiE显微图像分析软件进行分析。单细胞凝胶电泳结果采用Kinetic Imaging Comet 4.0软件进行分析，选定目标图像后由软件自动测量并输出尾长、尾矩和Olive尾矩数据，每个样本随机测量100个细胞。

1.5 统计学方法数据

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。数据以均数(x)±标准差(s)表示，组间差异采用one-way ANOVA分析。以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠肝、肾的DNA损伤

模型对照组小鼠肝、肾细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩较正常对照组均明显增加(P<0.01)。给予10，15 g/kg党参水提物后，小鼠肝肾细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩明显降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与正常对照组对比，党参水提物低、中、高各剂量组小鼠肝、肾细胞DNA尾长、尾矩、Olive尾矩仍呈现明显的增高趋势(P<0.01或P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肝、肾细胞DNA损伤对比n=20，x±s

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01； 与正常对照组对比， #P<0.05，##P<0.01。

2.2 小鼠肝、肾组织结构变化

正常对照组小鼠肝细胞为典型多边形腺上皮细胞，以中央静脉为中心，向四周呈放射排列，肝细胞边界清晰，细胞形态完整、整齐，细胞核圆形位于细胞中央，核膜清楚，核仁也清晰可见。模型对照组肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，胞浆疏松化，细胞脂肪变性清晰可见,炎细胞浸润明显。党参低剂量组肝细胞形态依然不齐，细胞脂肪变性、炎性浸润明显。党参中剂量组中央静脉周围部分细胞结构恢复正常，但距离中央静脉略远处细胞脂肪变性仍较明显。党参高剂量组肝细胞变性明显改善，炎性浸润显著减轻,细胞边界较为清晰,形态较完整，细胞排列也较为整齐。见图1。

正常对照组

模型对照组

党参水提物低剂量组

党参水提物中剂量组

党参水提物高剂量组

正常对照组小鼠肾小球呈圆形，外周规整，肾小囊的囊腔正常，肾小管的管腔规整。模型对照组小鼠肾小球不规整，可见部分萎缩的肾小球，肾小管上皮细胞肿胀、变性或坏死，灶状小管萎缩，肾间质呈现明显的纤维化病变。党参水提物各组肾组织异常变化有所改善，其中高剂量组肾小球萎缩明显缓解，肾小管上皮细胞肿胀、变性有所缓解，肾间质纤维化病变也明显缓解。见图2。

正常对照组

模型对照组

党参水提物低剂量组

党参水提物中剂量组

党参水提物高剂量组

3 讨 论

DNA是生命遗传的物质基础，也是生命信息的载体，它的稳定对于生命体的正常繁殖和生长至关紧要。研究表明，随年龄增长，机体内DNA损伤程度明显增加[5-7]，而DNA损伤修复能力明显下降[8-10]。当DNA损伤累积到一定程度后可导致转录失调，从而引起生物体适应性降低并最终表现为衰老[11]。

本研究中的单细胞凝胶电泳结果显示：模型对照组小鼠肝、肾细胞DNA损伤程度明显增加。给予党参水提物后，小鼠肝、肾细胞DNA损伤减轻，高剂量组减轻尤为显著。此说明高剂量党参水提物可通过减缓肝、肾细胞DNA损伤的方式而起到延缓衰老的作用；但与正常对照组对比，党参水提物各剂量组肝、肾细胞DNA还是处于较高的损伤状态，说明党参只能在一定程度上减轻肝、肾细胞DNA的损伤，并不能完全扭转衰老致DNA损伤的积累。

病理切片观察显示：模型对照组肝细胞肿胀，胞浆疏松化，细胞出现明显变性、坏死；部分肾小球萎缩，肾间质呈现明显的纤维化病变。肝、肾脏是人体的重要器官，其结构的异常改变必然导致肝、肾组织功能的下降。给予党参水提物后，肝细胞变性改善，炎性浸润减轻，肾小球萎缩缓解，肾小管上皮细胞肿胀、变性减轻，揭示党参水提物对衰老致肝、肾组织结构损伤有一定的修复作用。

本实验结果表明：党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾损伤具有一定的保护作用，其作用机制可能是通过减轻肝、肾细胞DNA的损伤，减缓衰老致肝、肾组织结构退行性病变，达到延缓衰老的作用，而更深入的机制探讨尚需进一步研究。

[1]周安方,郭煜晖,舒劲松.肾脾虚损导致衰老的机理探析[J].湖北中医杂志，2011,33(8):23-24.

[2]王玉芳.肝调节气机是补肾健脾抗衰老的前提[J].中医药信息， 2012,29(1): 8-9.

[3]杨婧,杜万红.浅谈中医学对衰老的认识[J].中医药导报， 2010,16(8): 129-131.

[4]Singh NP,McCoy MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp Cell Res，1988,175(1): 184-191.

[5]Chevanne M,Caldini R,Tombaccini D,et al.Comparative levels of DNA breaks and sensitivity to oxidative stress in aged and senescent human fibroblasts: a distinctive pattern for centenarians[J].Biogerontology，2003,4(2): 97-104.

[6]Sedelnikova OA,Horikawa I,Zimonjic DB,et al.Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepairable double-strand breaks[J].Nat Cell Biol,2004,6(2):168-170.

[7]Hamilton ML,Van Remmen H,Drake JA ，et al.Does oxidative damage to DNA increase with age[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10469-10474.

[8]Waldstein EA,Peller S,Setlow RB.UV-endonuclease from calf thymus with specificity toward pyrimidine dimers in DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(8):3746-3750.

[9]Nette EG,Xi YP,Sun YK,et al.A correlation between aging and DNA repair in human epidermal cells[J].Mech Ageing Dev,1984,24(3):283-292.

[10]韩宗超,张苏明,方思羽，等.彗星实验检测氧化介导的大鼠神经细胞DNA损伤与修复[J].中华老年医学杂志,2000,19(2):115-118.

[11]Bahar R,Hartmann CH,Rodriguez KA，et al.Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart[J].Nature,2006,441(7096):1011-1014.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0063-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.30

耿广琴(1971-)，女，甘肃兰州人， 讲师，硕士，主要从事生物化学的教学及研究。

杨雅莉，讲师，yali5642@sina.com

甘肃省教育厅科研项目 (2013A-087)

2015-02-08；

2015-09-10