反相高效液相色谱法测定金嗓口服液中绿原酸含量

余晟岚，徐 果

（1.重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010； 2.中国人民解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042）

金嗓口服液是医院生产的中成药口服液，具有外透风热、内散肺郁、清热解毒及利咽宣声的作用，适用于风热犯肺结于咽喉所致的声音嘶哑及急慢性咽喉炎、急慢性扁桃体炎。其主要成分为金银花、板蓝根、黄芩、薄荷、玄参等中药，在相关标准中只对金银花中的绿原酸有定性鉴别，而无有效成分的含量测定，且金银花为主要成分。为更有效地控制质量及提高标准，笔者采用高效液相色谱法测定该复方制剂中绿原酸的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

VARIN型双泵高效液相色谱仪，Prostar 210UV型检测器。绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号为10753-200413）；金嗓口服液（第三军医大学大坪医院自制，批号分别为130113，130227，130308）；甲醇（批号为 1001743）为色谱纯，磷酸（AR，批号为 110214），水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Ultimate ODS C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.5% 磷酸溶液（26 ∶74）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：328 nm［1-5］；灵敏度：1.0 AUFS；柱温：室温；进样量：10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 500，色谱图见图1。

2.2 对照品贮备液制备

称取真空干燥的对照品绿原酸约10.50 mg，精密称定，用50%甲醇溶解，定容至50 mL容量瓶，摇匀，作为对照品贮备液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取 2.2项下对照品贮备液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置 10 mL 容量瓶中，用 50% 甲醇定容后摇匀，各进样10 μL，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝14 324 219.73 X+974 813.5，r＝0.999 8（n＝7）。结果表明，绿原酸质量浓度在0.010 5～0.126 0 g／L范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取质量浓度为0.0105g／L的同一绿原酸对照品溶液10 μL，重复进样7次，测定峰面积。结果的 RSD＝1.04%（n＝7），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：将同一供试品溶液放置 0，2，4，12，18，24，36 h后，分别依法各进样10 μL，测定峰面积并计算样品含量。结果峰面 积 的 RSD 分 别 为 2.0% ，1.9% ，2.1% ，含 量 的 RSD 为2.31%，2.25%，2.30% （n ＝7）。表明供试品溶液在 36 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为130117）样品5份，制备供试品溶液，照拟订方法进样测定峰面积。结果的 RSD＝1.6%（n＝5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取样品（批号分别为120815，121015，121206，130117，130227，130308）6 份各 1 mL，置 10 mL 容量瓶中，另精密加入绿原酸对照品 0.5，1.0，2.0 mL，按样品含量测定项下方法分别测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 绿原酸加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

精密吸取样品（先用低温离心机以3 000 r／min的速率离心15 min）6 mL，置50 mL棕色容量瓶中，超声处理20 min，加入50%甲醇溶液至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，精密吸取滤液4.0 mL到50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度，作为供试品溶液。依法测定5批样品，用外标法计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝5）

3 讨论

采用RP-HPLC测定金嗓口服液中绿原酸的含量，方法简便、快速、重复性好。在色谱条件的选择试验中，分别比较了0.02 mol／L的磷酸二氢钠 -甲醇（75∶25，调 pH ＝3.2）与乙腈 -0.5% 磷酸溶液（26∶74）2种流动相，分别采用同1种ODS C18柱测定。结果以后者为流动相时获得良好分离［6-7］。

取对照品溶液，在200～800 nm波长范围扫描，结果绿原酸在328 nm波长处有最大吸收，故选择328 nm为检测波长。

供试品溶液的制备过程中采用了2种方法。方法一：取样品20 mL，置水浴上蒸干，加入50%甲醇热溶，过滤，取滤液6 mL（低温离心机以3 000 r／min离心15 min），置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，精密吸取4 mL置50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度。方法二：精密吸取样品（先用低温离心机以3 000 r／min离心15 min）6 mL置50 mL棕色容量瓶中，超声处理20 min，加入50%甲醇溶液至刻度，用0.45μm的微孔滤膜过滤，精密吸取滤液4.0 mL至50 mL棕色瓶中，加50%甲醇至刻度。测定结果显示，方法一杂质峰很多，相邻峰不容易分开；而方法二相邻峰对主峰无干扰，杂峰明显减少，并且峰形对称。故选择方法二作为供试品溶液的制备方法［8-10］。

供试品溶液稳定性试验表明，24 h内测定时峰面积一致，但随着放置的天数增加，绿原酸峰面积有所减少。

作为院内自制制剂，为更好地保证每一批次样品的含量一致并提高质量控制标准，更好地为临床用药服务，笔者认为，对绿原酸含量测定结果应控制在2.0 g／L以上。

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